荧光定量PCR实验的影响因素小结

1、荧光定量PCR实验的影响因素小结引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其 重要。可以说，不合理的设计意味着绝对的失败。但是，好的设计并不等于好的 实验结果，影响PCR和荧光PCR的因素非常多，下面择其重要进行介绍。1、引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50%的引物和互补序列表 现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态 下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减 少非特异性结合。合理的退火温度从55到70C。退火温度一般设定比引物的 Tm 低 5C。设定Tm有几种公式。确定引物Tm最可

2、信的方法是近邻分析法。大部分计 算机程序使用近邻分析法一一从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂 交稳定性。所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如 下进行：以低于估算的Tm5C作为起始的退火温度，以2C为增量，逐步提高退 火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳 结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5C，就会由于 在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同， 将退火温度设定为比最低的Tm低5C。或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计

3、的退火温度进行剩 余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。2、引物浓度引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5p M。较高的引 物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm （OD260） 测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers 法则（公式1）计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双 链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系 数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在oligo软件上可以计算出引物的 的消光系数（OD/u mol）和消光系数的

4、倒数3 mol/OD）。一般商业合成的引物以O.D.值表示量的多少，在一般情况下，20个碱基长 的引物，1个O.D.加100ul水后引物浓度为50pmol/ul （50p M）。也可以用OLIGO 软件，根据引物的的消光系数（OD/u mol），计算出一定的工作浓度下，引物的 加水量。浓度（U M）=A260 （OD/ml）X稀释系数X消光系数的倒数（nmol/OD）举例：计算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10p l稀释100倍（加 入990p 1）水中。在A260处测吸光度为0.2。计算消光系数的倒数为4.8 nmol/OD, 代入得：浓度= 0.2 （OD/m1）X 100X4.8

5、 （nmo1/OD）=96nmo1/m1 = 96 M3、引物、探针的纯度和稳定性定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。部分应用需要纯化，以 除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学 的效率不是100%。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使 DNA从3到5合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50 个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。 最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100p M。也可以用双蒸水溶解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物

6、储存在-20C。以大 于10p M浓度溶于TE的引物在-20C可以稳定保存6个月，但在室温（15C到 30C ）仅能保存不到1周。十粉引物可以在-20C保存至少1年，在室温（15C 到30C ）最多可以保存2个月。探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记，标记本身有效率的区别。探针标记以 后一般应该纯化，纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高，且保存时间可以高 达一年以上。不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别。由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2uM （10X），作为工作浓度分装多支，避光保存。4、热启动热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要

7、的方法之一。 尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72C，聚合酶在室温仍然有活性。因此， 在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会 产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引 物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA 工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于 预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完 全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到？（仪达到变性

8、温度。包 括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高 通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包 裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡 熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法 比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。Transitor Hot Start Taq酶对于自动热启动PCR来说高效可靠。Transitor Hot Start Taq是在常规Taq酶的基础上进行了化学修饰，使得该 酶在低温或常温下没有酶活，因此在加样至PCR扩增前，不会产生由于引物随机 粘连

9、而形成的非特异性扩增。高温条件下，化学修饰集团会被剪切，从而释放酶 活。此外，随着PCR扩增的进行，酶活会被逐步释放，有效提高扩增效率及产物 量。Transitor Hot Start Taq DNA聚合酶在变性步骤的95C保温过程中要持 续20分钟才会被释放到反应中，从而完全恢复聚合酶活性。5、镁离子浓度镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引 物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的 游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含 200p M dNTP的实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子

10、溶液（普通 PCR是1.5mM）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩 增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，普通PCR从1mM到3mM，以0.5mM递增， 进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Transitor Hot Start Taq酶。Transitor Hot Start Taq DNA聚合酶能够在比一般的Taq DNA聚合 酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化。6、模板质量模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在 标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01 %时就会抑制扩增 反应。分离基因

11、组DNA较新的方法包括了 DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及 FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮 存DNA。应注意进行PCR反应的模板质量，以增加PCR反应的成功率。7、模板浓度起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数PCR扩增和荧光PCR扩增， 104到106个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线（或在漠化乙锭染色胶上 观察到）。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（下表）。举例说，100ng到 川g的人类基因组DNA，相当于3X104到3X105个分子，足以检测到单拷贝基 因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DN

12、A的量是pg级的。对 于一般的检测样品，10100ng的量就足够检测了。当然对模板做一个梯度稀释， 对于定量PCR而言是非常容易，且能分析扩增效率。8、防止残余（Carry-over ）污染PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染 可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发 生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA 也会是污染源（非残余污染）。可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用带滤芯的移液 管可以阻止气雾剂进入eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离 的区域，在准备新反应前更换于套。总是使用不含有模板的阴性对