JJF(鲁) 138-2022 荧光定量PCR仪校准规范

1、山东省地方计量技术规范JJF（鲁） 1382022实时荧光定量PCR 仪校准规范Calibration Specification for Real-Time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction Analyzer20220624发布20220701实施山 东 省 市 场 监 督 管 理 局发 布JJF（鲁） JJF（鲁） 1382022JJF（鲁） 138-2022JJF（鲁） 138-2022校准规范Calibration Specification for Real-Time Fluorescent Quantitative

2、 Polymerase Chain Reaction Analyzer归 口 单 位：山东省温湿度计量技术委员会主要起草单位：潍坊市计量测试所北京林电伟业电子技术有限有限公司本规范委托山东省温湿度计量技术委员会负责解释本规范主要起草人：）尹义（东省量科研究） 张娟潍坊计量试所）参加起草人：张文（东省量科研究） 孙爽潍坊计量试所）李莉青岛计量术研院）朱娟北京电伟电子术有公司）目录 HYPERLINK l _bookmark0 引言（II） HYPERLINK l _bookmark1 1范围（1） HYPERLINK l _bookmark2 引用文件（1） HYPERLINK l _bookm

3、ark3 术语和计量单位（1） HYPERLINK l _bookmark4 4概述（3） HYPERLINK l _bookmark5 计量特性（4） HYPERLINK l _bookmark6 校准条件（5） HYPERLINK l _bookmark7 环境条件（5） HYPERLINK l _bookmark8 测量标准及其他设备（5） HYPERLINK l _bookmark9 校准项目和校准方法（6） HYPERLINK l _bookmark10 校准项目（6） HYPERLINK l _bookmark11 校准方法（6） HYPERLINK l _bookmark12 校

4、准结果表达（13） HYPERLINK l _bookmark13 复校时间间隔（13） HYPERLINK l _bookmark14 附录A校准原始记录格式（14） HYPERLINK l _bookmark15 附录B校准证书内页格式（18）附录C温度示值误差测量不确定度评定示例（19）附录D阈值循环数示值误差测量不确定度评定示例（22）I引言JJF 1071国家计量校准规范编写规则、JJF 1001通用计量术语及定义、JJF 1059测量不确定度评定与表示共同构成支撑校准规范制修订工作的基础性系列规范。校准方法及计量特性等主要参考了JJF 1527-2015 聚合酶链反应分析仪校准规范

5、、YY/T 1173-2010聚合酶链反应分析仪编制。本规范为首次发布。II实时荧光定量PCR 仪校准规范范围本规范适用于实时荧光定量 PCR 仪的校准，其他类型 PCR 仪相同原理部分可参照本规范执行。引用文件本规范引用了下列文件：JJF 1527-2015 聚合酶链反应分析仪校准规范YY/T 1173-2010 聚合酶链反应分析仪凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范。术语YY/T 1173-2010 中界定的及以下术语和定义适用于本规范。PCR（聚合酶链反应）polymerasechain reactionP

6、CR 即聚合酶链反应是一种对特定的DNA 或 RNA 片段在体外进行快速扩增的方法， 由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。YY/T 1173-2010,术语和定义 3.1PCR仪（聚合酶链反应分析仪）polymerasechain reactionanalyzer,PCRanalyzerPCR DNA RNA 的复制过程，在模板、引物、聚合酶等存在的条件下，特异扩增已知序列，对其进行检测分析的仪器设备。YY/T 1173-20103.2实时荧光定量 PCR real-time fluorescent quantitative PCR analyzer , RFQ-PCR analyzerDNA

7、 RNA PCR 过程中荧光染料释放的荧光强度的变化仪器设备。temperature indication error温控装置（如均热块）的设定值与所有采样孔实际温度平均值之差。单位：摄氏度， 符号：。1temperature uniformity符号：。temperature volatility在被检设备稳定的状态下，在规定的时间间隔内，均热块所有采样点中任意一点温度随时间的变化量。单位：摄氏度，符号：。temperature maximum overshoot（高于或低于定值的最大幅度。单位：摄氏度，符号：。meanheating rate升温过程中模块单位时间内上升的平均温度值。单位：

8、摄氏度每秒，符号：/s。mean cooling rate降温过程中模块单位时间内下降的平均温度值。单位：摄氏度每秒，符号：/s。fluorochrome由短波长激发光激发，释放出可见光的试剂。YY/T 1173-2010,术语和定义 3.12。precision offluorescence intensity对多个检测孔在同一荧光条件下重复荧光强度检测，其检测值的一致性。3. 12 阈值循环数 Ct (Cp) cycle threshol，crossing point均热块测量孔内的荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。主要的计算方式是以扩增过程前 315 个循环的荧光值的 10 倍标准

9、差为阈值，当荧光值超过阈值时的循环数则为阈值循环数(Ct)。YY/T 1173-2010,术语和定义 3.15。3. 13 阈值循环数精密度 precision of threshold cycle均热块不同测量孔在同一荧光条件下，阈值循环数重复测量的一致性。3. 14 熔解温度 melt temperature,Tm全总 DNA 双螺旋结构降解一半时的温度称为熔解温度。单位：摄氏度，符号：。3. 15 熔解曲线 melt curvePCR 过程中均热块测量孔的荧光强度（纵坐标）与温度（横坐标）形成的曲线。3. 16 熔解温度漂移 melt temperature bias根据熔解曲线计算的熔

10、解温度值与光学标准器熔解温度设定值之差。 单位：摄氏度，2符号：。3. 17 峰值强度 peak intensity熔解曲线上熔解温度对应的荧光强度。通道峰值强度一致性channel peak height consistency, CPHC熔解曲线上，所有采样测量孔峰值强度的变化趋势。PCR PCR 仪 ，CPHC 为 1.00。linearsensitivity factor, LSF同一熔解温度下，表征熔解曲线线性变化灵敏程度的比率。PCR 1.00。 LSF 0.80 1.20 之间，溶解曲线呈现基本线性；LSF 1.20：在低荧光强度下线性降低，注意最小信号检测和灵敏度。熔解温度比r

11、atio of melt RTm同一熔解温度下，表征熔解温度飘移因素的比率。RTm 0.80 1.20 之间：相同产品熔解温度不同，差异仅基于控温模块特性，熔解峰漂移与RTm 1.20：相同产品熔解温度不同，差异是由控温模块、光学和光学检测系统RTm 0.80：相同产品熔解温度不同，差异是与光学、光学检测系统及分析软件直接相关。3. 21 样本示值误差 error of samples indication一次融-冻转换过程结束到下次冻-融转换过程开始之间的过程。3. 22 样本线性 samples linearity系列稀释标准物质扩增 Ct 值对浓度对数值的线性回归系数。概述PCR 仪，全

12、称为实时荧光定量聚合酶链反应分析仪（real-time luosent quntittive PCR nlzeRPCRPCR仪PRPCR 3基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化的荧光信号强度，即可对待测扩增基因进行定量分析。PCR 32 48 96 384 96 孔板应用最为广泛。其主要由软件控制系统、温度控制模块、荧光检测模块、均热块检测孔组成，详细结构如图 1 所示。应用于新冠病毒核酸快速检测的仪器检测通量通常不大于 16。图1实时荧光定量PCR 仪结构示意图1光源 2滤光片 3准直器 4光导束 5样品 6均热块检测孔 7温度传感器 8加热制冷供电9光开关阵列 10光

13、敏器 11电控装置 12通讯接口 13计算机计量特性实时荧光定量 PCR 仪计量性能指标如表 1 所示。表1实时荧光定量PCR 仪计量性能指标序号项目技术指标备注1温度示值误差30，50，60，70，9095。0.5温度项目2温度均匀度1.03温度波动度0.24温度最大过冲量/5平均升温速率50901.5/s6平均降温速率90501.5/s4续表1实时荧光定量PCR 仪计量性能指标7阈值循环数示值误差2.5光学系统物理项目8阈值循环数均匀度59阈值循环数精密度1010通道峰值强度一致性10.211线性灵敏系数10.212熔解温度飘移113熔解温度比10.214样本示值误差15%光学系统生物化学

14、项目15样本线性相关系数0.980注：以上所有指标不适用于合格性判别，仅供参考。校准条件环境条件6.1.1（1530）；环境湿度：20R85R；6.1.2其它：仪器应远离振动、电磁干扰。测量标准及其他设备光学标准器最大允许误差为0.10.5s；发射光发生器的波长范围为（360 780）nm10%100%范围内可调。也可用满足上述技术要求的其他标准器。标准物质DNA 其特性量值（拷贝数量109opis/，5%,2。移液器规格：2L、10L、100L、200L、1000L，且需要计量检定合格。校准项目和校准方法校准项目校准项目主要分为温度项目和光学系统项目两大类，具体项目见表 1。校准光学系统5项

15、目时，可根据客户要求与实际情况选择光学系统物理校准方法或光学系统生物化学校准方法中的一种方法进行校准。对校准结果产生疑义或仲裁时，应采用光学系统生物化学校准方法。校准方法校准前的准备工作PCR 96 12 个，布点图（48 孔为例)2 2 PCR 仪均热96 15 3 3 PCR 少测量点数量并图示说明。校准前将实时荧光定量 PCR 仪预热 30min。将仪器及光学标准器各部件连接完好，在光学标准器下部的温度传感器表面上涂抹适量导热油，以确保其与均热块测量孔接触良好。将光学标准器分布于均热块测量孔中。JJF A 执PCR JJF B 2 12 个光学标准器位置分布示意图 图 3 15 个光学标

16、准器位置分布示意图校准过程2 411 所示（45 56 5102 1216 所示（12 1332 次63 PCR 2 3 定，并说明具体参数校准时所选取的温度值。表2温度项目、光学系统物理项目典型的校准设置程序步骤设定温度点（）持续时间（s）备注13060预热程序295603306043060温度技术指标校准程序5951806301207901808501809701801060180113060128510模拟光学扩增程85/60 32 次，同时进行光学检测。136030149515扩增变性程序156030熔解曲线分解过程169515表3光学系统生物化学项目典型的校准设置程序步骤设定温度点（

17、）持续时间（s）循环数15012012956001395304546060温度项目校准温度示值误差30s 5 值误差的计算按照公式（1）计算：式中：T 温度示值误差，；T 1 nTin i1（1）7Ts 设定温度值，；第i个温度传感器测量值平均值，；n 温度传感器数量。温度均匀度30s 5 匀度的计算按照公式（2）计算：Tu T max T min（2）式中：Tu 温度均匀度，；Tmax 所有测温传感器测定值平均值的最大值，；Tmin 所有测温传感器测定值平均值的最小值，。温度波动度30s 60s10 照公式（3）计算：Tfmax(Tjmax Tjmin)/（3）温度波动度，；Tj max 测

18、量点 j 温度传感器在 m 次测量中的最高温度，；Tj min 测量点 j 温度传感器在 m 次测量中的最低温度，。温度最大过冲量温度过冲量的计算按照公式（4）计算：Tt Ttmax - Ts（4）温度最大过冲量，；8Tt max 上升或下降达到设定温度后，所有温度传感器测得的温度最高或最低测量设定温度值，。平均升温速率PCR 5090时，平均升温速率的计算按照公式计算： 5Tah（ni1nn（ ）式中：Tah 平均升温速率，/s；thi50温度点第i个采样测量孔的测量值，；90温度点第i个采样测量孔的测量值，；从Tai 到达Tbi 的时间，s；n 温度测量点的个数。平均降温速率仪器从 90降

19、温至 50时，平均降温速率的计算按照公式（6）计算：ni inTac （i1（6）式中：Tac 平均降温速率，/s；tci从Tbi 到达Tai 的时间，s。光学系统物理校准法阈值循环数示值误差、均匀度和精密度Ct 精密度按照公式（9）Ct Ct 值精密度的表征。Cti Ctqi Cts（7）9Ctu Ctqmax Ctqmin（8）nnm（tqinntqi i12n式中：RSDCt ntqini1 i1100%m 1（9）Cti Ctqi CtsCtu第 i 个采样测量点阈值循环数 Ct 示值误差；第 i 个采样孔荧光信号达到阈值时的实时荧光定量 PCR 仪的阈值循环数；荧光信号达到阈值时光学

20、标准器实际经历的循环数；阈值循环数均匀度；Ctqmax 所有采样孔荧光信号达到阈值时的阈值循环数最大值；Ctqmin RSDCt所有采样孔荧光信号达到阈值时的阈值循环数最小值；阈值循环数精密度；m光学标准器数量。通道峰值强度一致性、线性灵敏系数DNA 100%20%（值强度一致性（C ）F )，分别由公式（10、公式（11）计算：CPHCi B C（10）iLSFi Ai BiBi Ci（11）式中：CPHCi 通道峰值强度一致性；（ -2）时，第i个采样孔对应的荧光强度；10Ci（ +2）时，第i个采样孔对应的荧光强度；（ -2）时，所有采样孔对应的荧光强度平均值；（ +2）时，所有采样孔对

21、应的荧光强度平均值；Ai LSFi第i 个采样孔测量熔解曲线上温度Tm 对应的荧光强度；线性灵敏系数。熔解温度漂移和熔解温度比熔解温度漂移的计算按照公式（12）计算，熔解温度比的计算按照公式（13）计算。式中：Tmi Tmi TmsRTm (12)(13)Tmi 第i 个采样测量孔熔解温度漂移，；Tmi实时荧光定量 PCR 仪实测Tm 值，；Tms光学标准器Tm 值，；RTm 熔解温度比；Ttmin TmaxPCR仪的 最大值，；PCR仪的 最小值，；光学标准器设定Tm 时所有测温传感器测定值的最大值，；TminTm 时所有测温传感器测定值的最小值，。光学系统化学校准法该部分校准可参照 JJF

22、 1527-2015聚合酶链反应分析仪校准规范7.4 执行。JJF A JJF 1527-2015B PCR 反应PCR 书的标准物质反应板进行校准。11使用已经配置好的附有证书的标准物质反应板进行校准前，应震荡混匀。样本示值误差按公式（14）计算式中：c cc cs（14）c 样本示值误差，copies/Lcccopies/Lcscopies/L样本线性按公式（15）计算n (Cti Ct)(ln ci ln c)r i1（15）n n 式中：tii1Ct)2(lnii1ilnc)2r线性相关系数；Cti 系列稀释标准物质的第 i 个扩增 Ct 值；Ct 系列稀释标准物质的 Ct 平均值；l

23、n ci 系列稀释标准物质的第 i 个浓度的对数值；ln c系列稀释标准物质浓度对数值的平均值。校准结果表达校准结果应在校准证书（报告）上反映，校准证书（报告）应至少包括以下信息：标题：如“校准证书”；实验室名称和地址；进行校准的地点（如果与实验室的地址不同；证书或报告的唯一性标识（如编号，每页及总页数的标识；客户的名称和地址；被校对象的描述和明确标识；12日期；如果与校准结果的有效性和应用有关时，应对被校样品的抽样程序进行说明；对校准所依据的技术规范的标识，包括名称及代号；本次校准所用测量标准的溯源性及有效性说明；校准环境的描述；校准结果及其测量不确定度的说明；对校准规范的偏离的说明；校准证

24、书和校准报告签发人的签名、职务或等效标识；校准结果仅对被校对象有效的声明；未经实验室书面批准，不得部分复制证书或报告的声明。校准原始记录格式见附录 A，校准证书（报告）内页格式见附录 B。复校时间间隔由于复校时间间隔的长短由仪器的使用情况、使用者和仪器本身质量等诸多因素决定， 因此送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔。PCR 113附录A校准原始记录格式实时荧光定量 PCR 仪校准原始记录参考格式记录编号：第X 页共X 页基本信息委托单位名称：委托单位地址：仪器名称：制造厂商：规格型号：出厂编号：校准依据：标准器信息计量标准（器）名称计量标准证书号有效期至计量标准器证书号有效期至测量

25、范围准确度等级标准物质信息标准物质名称型号规格批号量值特性/不确定度证书编号有效日期环境温度：环境湿度：%RH校准员：核验员：次数测量点1次数测量点12345A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H1214JJFJJF（鲁） 1382022记录编号：第X 页共X 页设定温度点（）305060709095实测 温度 （）A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12平均值（）实测最高温度（）实测最低温度（）温度示值误差（）不确定度（）温度均匀度（）二、温度波动度设定点：次数测量点12345678910A1A4A7A10A12D1D7D12E4

26、E10H1H4H7H10H1215Tmax-Tmin305060709095测量点（）A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12温度波动度（）设定温度点（）305060709095最低或最高测量值（）温度最大过冲量（）平均升温速率（/s）平均降温速率（/s）记录编号：第X页共X页三、温度最大过冲量、平均升温速率和平均降温速率四、阈值循环数（Ct值）示值误差、均匀度、精密度（光学系统物理项目）类别荧光定量 PCR 仪光学标准器光学标准器不同分布位置测量的阈值循环数A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H1216记录编号：第X 页共X 页阈

27、值循环数示值误差不确定度阈值循环数均匀度阈值循环数精密度（LSF （）（光学系统物理项目）Tm 设定值（）Tmi（）Tmi（）AiBiCiAi-BiBi-CiCPHCLSFRTm光学标准器分布位置A1A4A7A10A12D1D7D12E4E10H1H4H7H10H12平均值项目测量值（copies/L项目测量值（copies/L）U1U 2样本示值误差：样本线性系数：17JJF（鲁） JJF（鲁） 1382022附录B校准证书内页格式校准结果设定温度点（）305060709095温度示值误差（）温度均匀度（）温度波动度（）温度最大过冲量（）平均升温速率（/s）5090平均降温速率（/s）905

28、0阈值循环数示值误差阈值循环数均匀度阈值循环数精密度通道峰值强度一致性线性灵敏系数熔解温度漂移（）熔解温度比样本示值误差（copies/L）样本线性相关系数温度校准结果的扩展不确定度：阈值循环数校准结果的扩展不确定度：以下空白18附录C温度示值误差测量不确定度评定示例测量方法PCR PCR PCR 15PCR 式（C.1）进行计算。测量模型T T 1 5 （C.1）式中：sii1T 采样测量孔内温度示值误差，；Ts 仪器设定温度值，；Ti 第i 个温度传感器测定值，。不确定度来源根据上述数学模型以及测量方法，其不确定度来源主要包括以下三个方面：测量重复性引入的标准不确定度分量；1温度传感器分辨

29、力引入的标准不确定度分量u；1温度传感器准确度引入的标准不确定度分量u2。测量不确定度评定重复性测量引入的不确定度分量9510 取温度测量值，15 C.1。合并样本标准偏差 按公式（C.2）计算：( y ( y y )2mn kjj 1 k 1m(n 1)（C.2）19式中：m 测量点的数量；n 每个测量点测量次数；ykj 第 j 个测量点第 k 次的测量值，；y j 第 j 个测量点测量值的平均值，；表C.1温度测量结果次数测量点不同测量点温度传感器测量结果（）12345678910A195.0194.9895.0194.9594.9894.9895.0195.0495.0194.98A49

30、5.2295.2295.2595.2595.2895.2295.1995.2295.1995.22A794.9394.9394.9394.9694.9394.9694.9394.9994.9194.96A1095.2695.2695.2695.2695.2695.2995.2695.2995.2695.26A1295.4995.4095.4095.4995.4695.5295.4695.4695.5295.46D195.0395.1595.0995.0995.0395.1295.0695.0995.0995.06D794.9094.8794.8794.8294.9394.9094.8794.8

31、494.8794.87D1295.3795.2695.2995.2995.3295.2095.2995.2995.3595.29E494.9494.8594.8594.8594.8594.9494.8894.8594.9794.91E1095.3795.2895.3495.2895.3495.3795.3195.2895.3495.31H195.4795.4795.5095.4795.5095.5095.4795.4795.4795.50H495.0395.1295.0695.0695.0395.0995.0695.0695.0995.06H795.0395.0095.0395.0095.00

32、95.0095.0095.0695.0095.00H1095.2595.2895.2595.3195.3195.2595.2895.2595.2595.28H1295.0194.9895.0194.9894.9594.9895.0194.9595.0395.01通过公式 C.2 计算出合并样本标准偏差如下：sp =0.0313由于每个点测量 5 次取平均值，因此重复测量引入的不确定度分量u1 为：51u sp51 0.01341温度传感器分辨力引入的不确定度u1温度传感器的分辨力为 0.01，分散区间半宽为 0.005，按均匀分布计算，31k =，则u为：3120u 0.00531 0.003

33、0.00531由于重复测量引入的标准不确定度分量u 大于分辨力引入的标准不确定度分量u ，两111者具有一定的相关性，因此在不确定度计算时不考虑由读数分辨力引入的标准不确定度分量u 。1温度传感器准确度引入的标准不确定度分量u2；0.13温度传感器的最大允许误差0.10.13合成标准不确定度ucu2 0.058u 2 u 2 u 12取k 2 ，则：uc =0.06U k uc =0.1221附录D阈值循环数示值误差测量不确定度评定示例测量方法PCR PCR 扩增光学标准器进行温度和光学数据采集。示值误差的计算按照公式（D.1）计算。测量模型Cti Ctqi Cts（D.1）式中：Cti 阈值

34、循环数示值误差；CtqiCts被测设备第 i个采样孔的阈值循环数；光学标准器第 i个采样孔的阈值循环数；不确定度来源根据上述数学模型以及测量方法，其不确定度来源主要包括以下三个方面：测量重复性引入的标准不确定度分量；1光学标准器分辨力引入的标准不确定度分量u；1光学标准器准确度引入的标准不确定度u2；测量不确定度评定重复性测量引入的不确定度分量10 11.50D.1 所示。合并样本标准偏差 按公式（D.2）计算。22表D.1阈值循环数测量结果次数测量点阈值循环数测量结果12345678910实时荧光定量PCR仪A111.3411.3711.2311.5611.5611.6411.7311.7611.2811.77A411.5511.7511.5611.2411.8411.3811.4211.3611.3711.35A711.5011.2411.2411.6311.7311.3711.5711.3711.5411.57A1011.2311.7311.6411.2511.5311.5611.