药典微生物相关培训 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法(通则1106)解析

1、中国药典2015版非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法(通则1106)解析马英英陕西省食品药品检验所2015年8月16日主2015版控制菌检查法主要变化培养基适用性要内容方法适用性和供试品检查控制菌鉴定程序常用鉴定方法简介Ch.P2015控制菌检查主要变化检验项目2010版中国药典大肠埃希菌（E.coli）大肠菌群（Coliform）2015版中国药典大肠埃希菌（E.coli）耐胆盐革兰阴性菌（Bile-TolerantGram-Negative Bacteria）沙门菌（Salmonella）沙门菌（Salmonella）铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa）金黄色葡萄球菌（S.aur

2、eus）梭菌（Clostridia）铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa）金黄色葡萄球菌（S.aureus）梭菌（Clostridia）白色念珠菌（C.albicans）白色念珠菌（C.albicans）Ch.P2010Ch.P2015控制菌检查大肠菌群乳糖胆盐发酵培养基肠道菌增菌液体培养基（耐胆盐革兰氏阴性菌） 乳糖发酵培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基脂培养基大肠埃希菌胆盐乳糖培养基4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基胰酪大豆胨液体培养基麦康凯液体培养基培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼 麦康凯琼脂培养基脂培养基沙门菌营养肉汤培养基四硫磺酸钠亮绿培养基胰酪大豆胨液体

3、培养基RV 沙门菌增菌液体培养基胆盐硫乳琼脂培养基或沙门、志贺 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基菌属琼脂培养基三糖铁琼脂培养基曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基三糖铁琼脂培养基铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基胰酪大豆胨液体培养基溴化十六烷基三甲銨琼脂培养基绿脓菌素测定用培养基溴化十六烷基三甲銨琼脂培养基金黄色葡萄球菌亚碲酸盐肉汤培养基胰酪大豆胨液体培养基卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯 甘露醇氯化钠琼脂培养基化钠琼脂培养基梭菌梭菌增菌培养基梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂培养基哥伦比亚琼脂培养基白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基念珠菌显色培养基沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基念珠菌

4、显色培养基1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基Ch.P2015控制菌检查主要变化培养体系培养体系 增菌培养基（广谱增菌培养基替代选择性增菌培养基）、预增菌、选择性增菌、分离用培养基种类变化；培养时间与温度变化。方法 培养基的适用性发生变化。 方法适用性发生变化（方法验证方法适用性）。供试品 强抑菌性样品的处理方式发生变化。Ch.P2015控制菌检查主要变化-结果判断方式Ch.P2010Ch.P2015增菌、分离（纯化）、生 增菌、分离（纯化）、生化试验（较多） 化试验（较少）适宜的鉴定试验 适宜的鉴定试验Ch.P2015：如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存

5、在于该供试品中，选择抑菌成份消除相对彻底的方法进行供试品的检查。（阳性对照可以不生长）培养基适用性测试项目接种量 培养条件判断标准液体培养基促生长 100cfu 各控制菌检查培养条 与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。能力件规定最短时间固体培养基促生长 100cfu 各控制菌检查培养条 被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。能力件规定最短时间培养基抑制能力 100cfu 各控制菌检查培养条 试验菌应不得生长件规定最长培养时间培养基指示能力 100cfu 各控制菌检查培养条 被检培养基上试验菌生件规定培养时间内 长的菌落大小、形态特征、指示反应情况等应于对照培养基

6、一致。培养基适用性控制菌检查培养基特性试验菌株耐胆盐革兰阴性菌肠道增菌肉汤促生长能力大肠埃希菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌抑制能力促生长能力+指示特性紫红胆盐葡萄糖琼脂麦康凯液体培养基铜绿假单胞菌大肠埃希菌大肠埃希菌沙门菌促生长能力抑制能力金黄色葡萄球菌大肠埃希菌促生长能力+指示特性麦康凯琼脂培养基RV沙门菌增菌液体培养基促生长能力乙型副伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌+指示特性木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 促生长能力乙型副伤寒沙门菌三糖铁琼脂培养基指示能力乙型副伤寒沙门菌培养基适用性控制菌检查培养基特性试验菌株铜绿假单胞菌 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力

7、金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌+指示特金黄色葡萄球菌 甘露醇氯化钠琼脂培养基 促生长能力性抑制能力大肠埃希菌生孢梭菌梭菌梭菌增菌培养基哥伦比亚琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基促生长能力促生长能力促生长能力生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌+指示特+指示能沙氏葡萄糖琼脂培养基 促生长能力性念珠菌显色培养基促生长能力力白色念珠菌大肠埃希菌抑制能力方法适用性和供试品检查方法适用性微生物检验：某种样品采用某种方法得到一个检查结果。供试品 方法的影响 有效性方法适用性和供试品检查方法适用性Ch.P2010方法验证10100cfuCh.P2015方法适用性不大于100cfu名称加菌量培养要求在最苛刻的条件

8、下培养（培养时间）结果判断 上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性（非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）中的“抗菌活性的去除或灭活”），并重新进行方法适用性试验。结果判断：如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在该供试品，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。方法适用性和供试品检查-耐胆盐革兰阴性菌定性方法适用性和供试品检查-耐胆盐革兰阴性菌定量预培养：将制备好的1：10的供试液，在2025 培养，培养时间使供试品中的细菌恢复但不增殖（约2小时）耐胆盐革兰阴性

9、菌的可能菌数（N）每1g（或1ml各供试品量的检查结果或）供试品种可能的菌数cfu0.1g或0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml0.1ml相当于0.1g或ml、0.01g或ml、0.001g或ml样品+-N103102 N103肠道菌增菌液体培养基3035培养2448小时紫红胆盐葡萄糖琼脂+-10 N102N103035培养1824小时注：（1）+代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长； -代表紫红单眼葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。（ ）若量减少 倍（如0.00供试品1ml，0.0001g或0.0001ml，10cm2样品），则每1g（1ml）供试品中可能的菌数（N）应相应增加1

10、0倍。VRBA：有菌落生长，检出耐胆盐革兰阴性菌 ，根据各培养管检查结果，查表得耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。210 0.01g 0.01ml 0.001g或或，阳性对照阴性对照方法适用性和供试品检查-耐胆盐革兰阴性菌耐胆盐革兰阴性菌(Bile-Tolerant Gram-Negative Bacteria)替代2010年版大肠菌群Coliform）：耐胆盐革兰阴性菌为一群无严格定义的微生物，通常它们被定义为能够在紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基上生长的微生物。它们包括无乳糖发酵但能够利用葡萄糖，能够在胆盐中生长的革兰阴性菌，例如，肠杆菌科、假单胞菌和气单胞菌属的一些胆盐耐受的革兰阴性菌。方法适用性和供

11、试品检查-耐胆盐革兰阴性菌讨论：（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）试验过程中第一步供试品加入胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂预培养是使待检菌“充分恢复”，但不增殖才能保证定量结果的准确；实际操作过程中如何保证“供试品中的细菌充分恢复但不增殖” 还有待进一步实践摸索。（3）肠道菌增菌液体培养基（牛胆盐）（4）肠道菌增菌液体培养基在培养耐胆盐革兰阴性菌时，会出现变色和不变色两种情况。变色可能是由菌体大量增殖或其产生的初级和次级代谢产物影响到该培养基的pH值进而引起亮绿发生变色反应。耐胆盐革兰阴性菌中大部分是产酸的，会引起培养基颜色变化，（加入大肠试验是否变

12、色）但也有不产酸或少产酸的（如铜绿假单胞菌）不会引起培养基变色。虽然该培养基会时而发生指示特性，但考虑到ICH中对颜色指示功能未作要求；耐胆盐革兰阴性菌包含细菌种类繁多，产酸能力差异大，颜色的改变也不统一，不宜统一要求；中成药本身颜色较深，可能会掩盖培养基颜色，影响颜色观察；等因素在修订时未加入该培养基的指示功能。试验中无论培养基浑浊与澄清，均应做分离培养、染色、镜检。方法适用性和供试品检查大肠埃希菌方法适用性和供试品检查大肠埃希菌讨论：（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）胰酪大豆胨液体培养基、麦康凯液体培养基和麦康凯琼脂培养基在对供试品进行前增菌或选

13、择性增菌时，尽量采取标准培养温度和培养时间的上限进行，有利于菌体的复苏、增殖和检出，尤其是对污染较轻或污染菌受损较严重的供试品。对于污染严重的供试品可根据实际情况按标准调节培养温度和时间。（3）药品中污染的大肠埃希菌，易受生产工艺及药物的影响，在麦康凯琼脂培养基上的菌落形态特征会发生变化。检验者在挑选菌落时都会尽量挑选最典型的菌落，但形成典型菌落的不一定是大肠埃希菌，部分非典型菌落也会是大肠埃希菌，因此该试验对检验者的经验要求较高，也造成了一定的主观性。要求检验者尽量多挑选菌落进行鉴别，以防漏检。方法适用性和供试品检查沙门菌方法适用性和供试品检查沙门菌讨论：（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和

14、、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）Ch.P2015沙门菌检查方法和所用的培养基较Ch.P2010更加完善。在相同实验条件下，TSB 较营养肉汤培养基更加丰富，更有利于细菌的复苏和繁殖，对营养要求苛刻的细菌也能很好的培养。RV沙门菌增菌肉汤的高渗透压，低pH和孔雀绿的抑菌作用使培养基的选择性作用更强，不仅抑制了革兰阳性菌，对肠杆菌科的细菌也具有不同程度的抑制作用。木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基上沙门菌特有的形态特征更有利于观察。（血清分型）（3）随着科学技术的发展，药典控制菌检查鉴别方法不作具体规定，由各实验室根据自身条件自行选择，以适应先进技术的发展，与国外药典控制菌检查的发展趋势同步

15、。这就要求各实验室要具备相当的条件设备和技术能力，才能适应新时期药品质量控制的要求。方法适用性和供试品检查铜绿假单胞菌检查方法方法适用性相当于1g、1ml、10cm2样品相当于1g、1ml、10cm2样品胰酪大豆胨液体培养基胰酪大豆胨液体培养基（铜绿）3035培养1824小时溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板3035培养18小时溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板3035培养18小时3035培养1872小时与阳性对照相比，菌落形态一致 ，阳性对照计数不大于100cfu。取平板上的菌落进行氧化酶试验或采用其它适宜方法进一步鉴定。阳性对照阴性对照方法适用性和供试品检查铜绿假单胞菌讨论：（1）若供试品具有

16、抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）在进行铜绿假单胞菌检验时，传统的方法是在分离纯化之后，进行革兰染色镜检、氧化酶试验，再进行一系列的绿脓菌素试验或者硝酸盐还原产气试验、42生长试验和明胶液化试验，也比较时力。与传统方法比较，用（如自微生物鉴定系统、PCR等）准确性高，鉴定度，但用较高。各实验室根据自身条件自行选择结品本身特，检验时限等因素，选择适宜的方法，会高检验的和准确性。方法适用性和供试品检查金黄色葡萄球菌检查方法方法适用性方法适用性和供试品检查金黄色葡萄球菌讨论：（1）若供试品具有抑菌性，应采用中和、稀释、薄膜过滤等方法去除抑菌活性。（2）在进行金黄色葡萄球菌检

17、验时，传统方法是在分离纯化，革兰染色镜检之后使用兔血浆进行血浆凝固酶试验，而兔血浆的质量和新鲜程度要求相对较高，否则容易得出假阴性结果。虽然在实验的同时使用了阳性对照和阴性对照作为参考，但遇到上述情况也比较费时费力，且对于凝固与否需要人工判断，结果又会有误差。与传统方法比较，借用仪器（如VITEK、PCR、RP等）准确性高，鉴定速度快，但费用较高。各实验室根据自身条件自行选择结合样品本身特点，检验时限等因素，选择适宜的方法，会提高检验的效率和准确性。方法适用性和供试品检查梭菌检验检查方法方法适用性相当于1g、1ml、10cm2样品2份一份置80 加热保相当于1g、1ml、10cm2样品2份一份

18、置80 加热保温10分钟后迅速冷却梭菌增菌培养基温10分钟后迅速冷却梭菌增菌培养基（生孢梭菌）3035厌氧培养48小时3035厌氧培养48小时哥伦比亚琼脂培养基平板3035 厌氧培养4872小时过氧化氢酶试验哥伦比亚琼脂培养基平板3035 厌氧培养48小时过氧化氢酶试验平板上有菌落生长，过氧化酶阴性，进行适宜的鉴定；过氧化酶阳性，判供试品未检出梭菌。与阳性对照相比，菌落形态一致 ，阳性对照计数不大于100cfu。过氧化酶阴性阳性对照阴性对照方法适用性和供试品检查白色念珠菌检查方法方法适用性相当于1g、1ml、10cm2样品相当于1g、1ml、10cm2样品沙氏葡萄糖液体培养基（白念）3035培

19、养3沙氏葡萄糖液体培养基3035培养35沙氏葡萄糖琼脂培养基平板（SDA）3035培养24小时沙氏葡萄糖琼脂培养基平板（SDA）3035培养2448小时取平板上的菌落种念珠菌 取平板上的菌落种念珠菌显色培养基平板上，培养或采用 显色培养基平板上，培养后与阳性对照相比，菌落形态一 致 。阳性其它适宜方法进一步鉴定。对照计数不大于100cfu。阳性对照阴性对照阴性对照为确认试验条件是否要求，应进行阴性对照试验，以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行差调查。阳性对照阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出相应

20、的控制菌。特情况除外控制菌鉴定微生物鉴定指导原则（通则9204）为非无菌产品微生物限度检查中控制菌的鉴定，以及药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指导。如果在药物原料、辅料、制药用水、生产环境，中间体和终产品中发现微生物，典型的做法是进行鉴别，包括鉴定和菌株分型。在某些时候，微生物鉴定需要达到更加明确的水平，如种属水平的鉴定。甚至进行菌株水平的鉴定，这种技术在污染调查的过程中非常有用，能够决定微生物污染的来源。对洁净室和其他受控环境分离到的微生物进行适当比率的鉴定，掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。控制菌鉴定确定实验室分离的微生物的类别，大类如细菌、酵

21、母菌或霉菌，或小类如属和/或种。在大多数非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中，利用菌落形态学、细胞形态学、不同的染色技术，以及氧化酶、过氧化氢酶和凝固酶反应等特征的生化反应，来确定实验室分离到的微生物的特性，如为非致病球菌或致病性球菌，可以满足趋势分析和调查需要而不是严格的微生物鉴定。微生物鉴定需要达到明确属或种的水平，甚至鉴定到菌株水平。控制菌鉴定鉴定步骤1、待检菌的分离纯化微生物鉴定的第一步是培养物的分离纯化。挑取待检菌在适宜的微生物固体培养基上连续划线分离纯化出纯培养物（单个菌落），必要时可进一步纯培养以获取待检菌的纯培养物，为表型鉴定和随后的鉴定程序提供足够量菌体。控制菌鉴

22、定2、初筛试验常规的微生物鉴定，一般要先进行初筛试验确定待检菌的基本微生物特征，将待检菌做初步分类。常见的初筛包括革兰染色、芽孢染色、镜检观察染色结果和细胞形态、重要的生化反应等。重要的生化筛选试验包括：氧化酶试验过氧化氢酶试验凝固酶试验初筛试验可为评估提供有价值的信息，对于微生物鉴定方法来说，初筛试验是最关键的一步，若给出错误的结果，将影响后续试验。控制菌鉴定生化反应-氧化酶试验原理：氧化酶或称细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸系统的终端呼吸酶，能直接利用氧分子作为受氢体，将底物上脱下来的氢与氧结合成水。作氧化酶试验时，此酶并不直接与氧化酶试剂反应，而首先使细胞色素c氧化，然后此氧化型细胞色素c再

23、使对苯二胺试剂氧化，使之成为玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物。主要用于区分不发酵的革兰阴性杆菌（氧化酶阳性）和肠道菌（氧化酶阴性）。控制菌鉴定生化反应-氧化酶试验操作过程：取洁净的滤纸置平皿内，用无菌接种环从平板上挑取单颗待鉴定的菌落或菌苔，均匀涂抹在滤纸上，滴上一滴氧化酶试剂，在1030秒钟内如果出现深紫色则为阳性反应，延缓反应或颜色不变色者则为阴性反应。注意事项： 含葡萄糖培养基上的菌落不宜做氧化酶试验。因葡萄糖发酵可氧化酶的活性，造成假阴性。 待检菌应避免同铁、镍等金属接触，故不宜用镍铬合金丝制成的接种环。 如果氧化酶试剂变成紫色时，则不能使用。 反应需在有氧条件下进行，勿将试剂滴加过多，以

24、免妨碍菌苔与空气接触，造成假阴性。控制菌鉴定生化反应-过氧化氢酶试验原理：细菌代谢产生过氧化氢，对菌细胞有毒，过氧化氢酶的作用是使过氧化氢分解成分子态氧和水，使其解毒。具有过氧化氢酶的细菌培养物，加入过氧化氢酶试液 ，立即产生气泡，即为阳性反应。绝大多数细菌的琼脂培养物均产生过氧化氢酶，但链球菌属为阴性，故常用于鉴别葡萄球菌、微球菌（阳性）与链球菌。操作过程：用无菌接种环挑取一环琼脂培养基上的可疑菌落置洁净的载玻片上，滴加过氧化氢酶试剂数滴，或于琼脂斜面培养物上直接滴加过氧氢酶试剂，立即观察结果。如果产生气泡者为阳性反应，不产生气泡者则为阴性反应。控制菌鉴定生化反应-过氧化氢酶试验注意事项试验

25、用的培养基、玻片不得含有血液或其它体液，因红细胞含有过氧化氢酶，易造成假阳性反应。试验必须用1824h的培养物，因陈旧培养可能丧失酶活性，出现假阴性反应。试验时，勿先加过氧化氢酶试剂再加菌，更不能用无菌接种环将菌苔与过氧化氢酶试剂相混合。试验时，应以已知阳性菌株作对照。控制菌鉴定生化反应-凝固酶试验 血浆凝固酶是一种能使血浆凝固的酶类物质。致病性的葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白，附着于细菌表面，形成凝块。 葡萄球菌产生的凝固酶有两种，一种是与细胞壁结合的结合凝固酶，它直接作用于血浆中的纤维蛋白原，使发生沉淀，可用玻片法测定；另一种是由菌体生成后释放于培养基中，叫做游离凝固酶，它能使血

26、浆中的凝固酶反应因子形成类似凝固酶的物质，间接地使纤维 蛋白原转变成纤维蛋白，可由试管法测定。 金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，该酶具有抗原性，能和兔血浆结合形成一种稳定的结合物，使血浆凝固，而其它的葡萄球菌没有该特性，所以可以用该反应来确认金黄色葡萄球菌的存在。控制菌鉴定3、表型微生物鉴定表型微生物鉴定依据表型特征的表达来区分不同微生物间的差异，是经典的微生物分类鉴定法，以微生物细胞的形态和习性表型为主要指标，通过比较微生物的菌落形态、理化特征和特征化学成分与典型微生物的差异进行鉴别。微生物分类中使用的表型特征见表。控制菌鉴定3、表型微生物鉴定控制菌鉴定3、表型微生物鉴定微生物细胞的大小和形态、

27、芽孢、细胞成分、表面抗原、生化反应和对抗菌剂的敏感性等表型，除受其遗传基因的控制外，还与微生物的分离环境、培养基和生长条件等因素有关。表型微生物鉴定通常采用增殖培养的方式获得实验所需要的大量纯化培养物，但长时间培养的方法有时对一些特定微生物的恢复、增殖作用是有限的，部分环境微生物在普通增殖培养基中甚至不能恢复；一些从初始培养物中刚分离出的受损微生物还有可能不能完整的表达其表型属性；因此，在表型鉴别时应注意培养基和传代次数对鉴定结果的影响。控制菌鉴定3、表型微生物鉴定目前已经发展出的基于微生物的生理、生化反应，脂肪酸构成分析（气液相色谱法）和全细胞成分分析(质谱法)等微生物鉴定系统，在进行结果判

28、断时需借助于系统自身的鉴别数据库，因此鉴定结果的准确性可能受实验中所使用的培养基和培养条件与建库时的特定培养基和培养条件的一致性影响。控制菌鉴定3、表型微生物鉴定表型微生物鉴定方法已广泛应用于药品微生物实验室。根据微生物表型所提供的信息可以掌握环境微生物群落的变化，并用于产品的风险决策。在许多质量控制调查中，单独的表型鉴定结果就能给出充足的信息帮助使调查人员进行深入调查，并按需要推荐适宜的纠正措施。利用表型微生物鉴定可对药品中发现的微生物进行常规鉴定和特定控制菌的鉴定。控制菌鉴定3、表型微生物鉴定常规的细菌鉴定是将检出目标菌的纯培养物进行革兰氏染色、镜检并以过氧化氢酶试验、氧化酶试验或凝固酶试

29、验三个特征生化反应，将细菌做初步分类：革兰氏阳性球菌：先通过过氧化氢酶试验，区分葡萄球菌(阳性)和链球菌(阴性)。再依据凝固酶试验推测葡萄球菌可能为致病性(凝固酶试验阳性)和非致病性(凝固酶试验阴性)。革兰氏阴性球菌：奈瑟菌属和布兰汉菌属等。革兰氏阳性杆菌：依据需氧情况，可分为厌氧菌（如梭菌属）、需氧或兼性菌（如过氧化氢酶试验阳性的棒状杆菌、李斯特菌、芽孢杆菌等；过氧化氢酶试验阴性的乳酸杆菌等）。革兰氏阴性杆菌：通过氧化酶试验区分为非发酵菌(阳性)和发酵菌即肠道菌(阴性)。控制菌鉴定4、基因型微生物鉴定与表型特征不同，微生物基因型通常不受生长培养基或分离物活性的影响，只需分离到纯菌落便可用于分

30、析。大部分微生物物种中核酸序列是高度保守的，因而DNADNA杂交、聚合酶链反应、16S rRNA序列 和 23SrRNA序列、多位点序列分型、焦磷酸测序、DNA探针和核糖体分型分析等基因型微生物鉴定方法理论上更值得信赖，但由于基因鉴定法需要昂贵的分析设备和材料，通常基因鉴定法仅在关键微生物调查中使用，如产品不合格调查，且必须经过确认实验。控制菌鉴定4、基因型微生物鉴定目前伯杰氏系统细菌学手册第二版中对细菌分类的描述是通过遗传物质的分析比较来实现的。通过未知微生物的DNA与已知微生物的DNA比较，能够确定亲缘关系的远近。基因型鉴定可通过DNA杂交、限制性酶切片段图谱的比较和/或DNA探针来完成。

31、控制菌鉴定4、基因型微生物鉴定若DNADNA的杂交亲缘关系大于70%时，即表明微生物是同一种属；系统发育典型的分析方法是通过比较细菌16SrRNA或真菌23S rRNA基因的部分碱基序列来实现。即经过聚合酶链反应(PCR)进行基因扩增、电泳分离扩增产物、以双脱氧链终止法进行碱基测序、与专用数据库（已经过验证）或利用公共的数据库（不一定经过验证）进行比对等过程。控制菌鉴定4、基因型微生物鉴定微生物分类学的基因型/系统发育的特征类别特征基因型DNA-DNA、DNA基比例（如G+C）、限制性酶和DNA16S rRNA 列和18S rRNA列系统发控制菌鉴定4、基因型微生物鉴定基于核酸的方法可以用来筛

32、选处于过渡期受损的微生物。将存在于过渡期与菌株生存能力相关的rRNA，通过逆转录的方法转换为可用于PCR扩增的DNA。解决了不能存活的细菌细胞中DNA的扩增问题。该方法经过样品收集、核酸提取、目的片段扩增、杂交和检测等步骤，涉及了变异微生物的检测、检测限、基质效应、正向截点的核查、仪器设备和系统携带污染、分析的精确性和试验的重现性等内容。控制菌鉴定4、基因型微生物鉴定-DNA的碱基组成碱基组成是各种生物一个稳定的特征。用G+C占全部碱基物质的摩尔百分比表示各类生物的DNA碱基组成特征。具有相似的G+C含量，则具有亲缘关系近的可能性。同一种内不同菌株G+C含量差别应在4%-5%。同属不同种的差别应低于10%-15%。常用鉴别方法介绍显色培养基原：利用不同种属细菌代谢所产生的酶的特异性，在培养基中加入相应的特异性