肿瘤与基因课件

1、 肿瘤与基因 2015-12-15人类基因组计划人类基因组计划（HGP）于1990年正式启动了2003年完成了所有研究目标。已完成的基因序列图覆盖了人类基因组99%的区域，精确率达到了99.99%。那是一部长达100万页，每页3，000个字符的巨著！诺贝尔获得者杜伯克曾说:人类的DNA序列是人类的真谛，这个世界上发生的一切事情，都与这序列息息相关。一个人的基因组信息要用3GB的光盘存储。一个人每分钟敲击60字，每天工作8小时，50年才能 全部记录一个人的DNA信息。每个人体内都有数万亿细胞，每个细胞的细胞核内 都有46个（23对）染色体。每个独立染色体就叫DNA。如果展开，仅一个细胞内的DNA

2、就能有1.83米，如果 把一个人的DNA全展开，长度相当于从地球到太阳610 次。环境因素物理因素化学因素生物因素体内微环境人类基因组肿瘤是一种环境因素与遗传因素相互作用导致的疾病, 大多数的环境致病因素的致癌作用都是通过影响遗传基因起作用的。肿瘤的发生源于遗传物质DNA的改变这种改变是多步骤完成的多个基因变化的细胞进化过程不仅癌基因之间有协同作用，癌基因与抑癌基因之间也存在协同作用 基因检测 基因检测与肿瘤？ 风险预测我是否易得某种肿瘤？复发监控疗效判断治疗选择预后判断临床分期鉴别诊断早期筛查我的肿瘤会如何进展？我现在是否可能有肿瘤？我的肿瘤是什么类型的？我的肿瘤扩散了吗？我的肿瘤回来了吗？

3、我的治疗起作用了吗？最适合我的治疗是什么？如：CtDNACTCPSACEAAFP 如：EML4-ALKHER2MSI 如：CTCCt-DNA 如：EGFRERCC1HER2 如：21基因CTC放疗敏感PAM50MSI放疗毒副 如：CTCCt-DNA 如：CTCCt-DNA 如：BRCA1/2CDH1APCMMRRET 基因检测方法介绍基因变异的检测方法显微切割+直接测序测序法荧光定量PCR法ARMS 方法Mutation-riched PCRPCR-SSCP甲基化的检测（Northern印迹，Western印迹，HRM）FISH CtDNA.Sanger Sequencing （1977） N

4、ext-Gen Sequencing （2005以后） Ion Semiconductor Sequencing （2011）测序技术发展历程直接测序法原理：双脱氧终止法特点：直接测出碱基序列，明确突变 类型。耗时长：23天。 Frederick Sanger13 August 1918 19 November 2013) 荧光定量PCR原理：应用一对双标记Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自对应的基因型；用两种荧光染料Fam，Hex（Vic）分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。特点：针对固定的已知突变、操作

5、简便、耗时短（2h） ARMS 方法原理：等位基因特异性扩增法（Allele Specific Amplification，ASA）建立于1989年，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻滞突变系统（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、等位基因特异性PCR（Allele Specific PCR，ASPCR）等。Mutation-riched PCR原理：利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点， 如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密码子有Bg位点。用 连续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13

6、密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 PCR-SSCP原理：在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种方法。将单链的扩增DNA或组织基因组DNA通过中性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据其电泳位置的改变可分辨出单个碱基的改变。 HRM原理：采用重亚硫酸盐处理DNA模板后，在非CpG岛位置设计一对针对经亚硫酸氢钠处理后DNA链的引物，这对引物中间包含有意义的甲基化CpG岛，一旦这些CpG岛发生甲基化，胞嘧啶不发生变化，而未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶，样

7、品中的GC含量发生了变化，最终被转化成溶解曲线Tm值之间的差异。特点：可检测抵达0.1%的甲基化程度，并且可以根据已知甲基化程度的标准曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定。ctDNA（液体活检）cfDNA（cellfree DNA），或者叫血浆游离DNA，是血浆中游离存在的DNA，它们有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿瘤细胞），还有部分来自于我们外部（如病毒DNA）。人们发现cfDNA中携带肿瘤特有突变的那一小部分DNA，是由肿瘤细胞释放出来的。这种携带了突变信息的循环DNA是肿瘤的标志，ctDNA的研究终于与肿瘤关联起来。ctDNA来源：1、来自于坏死的肿瘤细胞；2、来自于凋亡的肿

8、瘤细胞；3、来自于肿瘤细胞分泌的外排体。突变类型：点突变（SNV），短的插入缺失（InDel），拷贝数变异（CNV），结构变异（SV）等等。发现过程：70年代Leon等研究表明癌症患者外周血清DNA水平大大高于正常人。 肿瘤相关基因介绍第一代针对EGFR的靶向药易瑞沙（Iressa）和特罗凯（Tarceva） （针对位点：L858R、“19号外显子缺失”）2011年浙江贝达药业开发的EGFR靶向药物凯美纳（埃克替尼）在中国上市，号称第一个中国自己做出来的小分子靶向抗癌药物。第二代EGFR抑制剂，代表产品是阿伐替尼（afatinib） （针对位点：L858R、“19号外显子缺失”、 T790M）

9、第三代EGFR靶向药物还没有被FDA批准上市，但有几个已经在3期临床实验，代表药物是Clovis公司的CO1686，阿斯利康的AZD9291和诺华的EGF816（药物上市前一般都只有代号，没有名字）。K- rasK-ras 突变是结直肠发生的早期事件，K-ras 突变可促进肿瘤的恶性进展，EGFR抑制剂活性的预测性标记物突变热点：外显子2（密码子12，13 ），3（密码子61）检测方法： 显微切割+直接测序 直接测序 定量PCR Riched-mutant PCR靶向药物西妥昔单抗NCCN明确指出西妥昔单抗（爱必妥）用药之前须检测K-ras基因突变检测；K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治

10、疗（爱必妥）中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用；中国人群中K-ras基因突变率15% ！ 15%的病人不应该使用爱必妥！野生型突变型World J Gastroenterol. 2011 November 21; 17(43): 4779-4786. HER2人表皮生长因子受体2（HER2）是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。乳腺癌患者预后指标及曲妥珠单抗治疗的靶点；胃癌曲妥珠单抗靶向治疗的靶点。大约 1530% 的乳腺癌和 1030% 的胃 / 食管癌会发生 HER2 基因扩增或过表达

11、。HER2 的过度表达也可见于其他肿瘤如卵巢、子宫内膜、膀胱、肺、结肠和头颈部。ASCO/CAP2013指南关于乳腺癌HER2检测推荐：IHC检测HER2蛋白表达水平FISH检测HER2基因扩增FDA 2013年关于胃癌HER2检测流程建议ALK最早是在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL)的一个亚型中被发现的，因此定名为间变性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）。随后，在发现非小细胞肺癌中有ALK基因重排之前，在弥漫性大B细胞淋巴瘤和炎症性肌纤维母细胞瘤（IMT）中分别发现了有多种类型的ALK基因重排，至此证明ALK是强力致癌驱动基因。变异类型：重排检测方法：AL

12、K分离荧光原位杂交检测，是ALK诊断检测最终获得FDA批准，用于检测ALK基因重排非小细胞肺癌，连同克唑替尼获得美国批准的基础，也是目前唯一经临床验证的ALK检测方法。EML4-ALK融合基因克唑替尼的靶标已发现并确认至少9种EML4-ALK融合基因的突变体：v1、v2、v3a、v3b、v4、v5a、v5b、 v6、v7。检测方法：RT-PCR, FISH, PCR、测序等RBRB基因 (Retinoblastoma gene)即成视网膜细胞瘤基因，为视网膜母细胞瘤易感基因，是世界上第一个被克隆和完成全序列测定的抑癌基因。突变类型：缺失，突变。检测技术：PCR，PCR-SSCPP53 p53是

13、一种肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。突变热点：大部分突变是位于4个突变热点之一的错义突变。这4个突变热点是aa129146、 171179、234260、270287。检测方法：直接测序法PTEN1997年分离鉴定，定位于人染色体10q23。为p53，P16，P27基因后与肿瘤关系密切的一个新的抑癌基因。是至今在子宫内膜肿瘤中鉴定的最常见的突变基因(33-55%)。突变类型：等位基因缺失、基因突变、甲基化。C-kit c-kit基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，其产物是型酪氨酸激酶。大部分的胃肠道间质瘤（G

14、IST）均存在c-kit基因突变（90%），从而导致Kit蛋白的活化不需要配体SCF参与就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控。突变热点：11号外显子Lys550- Val560区段的变异最为常见（约占70-80%），位于9号外显子Ala502-Tyr503区段的6碱基重复突变约占5-10%。检测方法：直接测序法。PDGFRA血小板衍生生长因子受体定位于4q12-13 ，多发生于胃及十二指肠。多发生于exon18 、exon12：碱基置换突变最常见。检测方法：直接测序法。格列卫(Glivec)通用名：甲磺酸伊马替尼（Imatinib ）商品名：格列卫原理： 选择性抑制BCR-ABl 、C

15、KIT 、PDGFRA用途：治疗Ph+CML治疗不能切除或发生转移的恶性胃肠道间质瘤。总有效率（CR+PR+SD ） ：75%MiettinenM et al. Arch PatholLab Med.2006;130:1466-1478.nm23K-1735鼠的黑色素瘤细胞中分离鉴定的第一个转移抑制基因 (non metasitasis 23 cDNA )。变异类型：表达水平降低 、基因的缺失和突变检测方法：Northern杂交（检测表达量）、Southern杂交（检测缺失）KAI1KAI1基因与肿瘤的转移呈负相关, 其表达降低可促进肿瘤的侵袭和转移(肝癌乳腺癌胰腺癌黑色素瘤结肠癌喉癌和肺癌)变异类型：基因突变，等位基因缺失、表达水平的改变。 基因mRNA水平与抗肿瘤药物RRM1 NCCN 2012年版临床治疗指南明确指出：患者接受吉西他滨化疗前进行RRM1mRNA检测可提高治疗有效率和患者生存率(反比)。ERCC1表达与铂类药物疗效相关的临床数据（反比）。 ERCC1BRCA1/2 TSBRCA1/2表达与铂类药物疗效相关的临床数据（反比） TS高表达影响氟类和培美曲塞药效（反比） BRCA1过度表达铂类耐药的预测因子抗微管类药物的敏感因子低TSmRNA水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好，中位生存期较长。TS低表达的患者对