生物分离-细胞破碎课件

1、细胞破碎生化分离工程 胞内产物：胞内酶、大部分重组蛋白等。 细胞破碎：破坏细胞壁或细胞膜 一、细胞壁的结构和化学组成1.细菌的细胞壁1550nm4090%肽聚糖1.52nm810nm2.酵母的细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质构成，比G+更难破碎。 其他真菌细胞壁：主要由多糖组成(几丁质、纤维素) 酵母细胞壁结构示意图 M甘露聚糖；P磷酸二酯碱；G葡聚糖酵母细胞3.植物细胞和动物细胞 植物细胞：纤维素 动物细胞：无细胞壁 原核和真核细胞膜：脂质和蛋白构成1、高压匀浆法高压匀浆器针型阀结构简图 高压匀浆器各种阀型设计 5070MPa450m/s高压匀浆法适合于酵母和细菌的大规模破碎不适于团状或丝状

2、菌破碎 2. 珠磨法玻璃(2.5g/mL)氧化锆(6.0g/mL)粒径(0.11.0mm)填充率(8085%)ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机S 破碎率；t为破碎操作时间或平均停留时间; k破碎速度常数，与搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠直径以及温度等操作因素相关优点：容易操作，破碎率可控制，易放大；实验室和工业规模均可用；绝大多数微生物细胞均适用缺点：产生大量热能，能量利用率仅1%；影响破碎率的操作参数较多，操作过程优化较复杂 搅拌设计要能够给予研磨剂以最佳推动力，一般设计为搅拌盘。搅拌盘与驱动轴有同心的，也有偏心的；有垂直的，也有倾斜的。有的搅拌盘上有凹槽或是开度口以帮助搅

3、拌。珠磨机搅拌盘设计图 珠磨机搅拌盘与驱动轴方位示意图缺点：有效能量的利用率低，产热大，需控温（冰水或通冷却剂）；不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎；影响因素多，细胞种类、浓度、超声波的声频等4.低渗裂解（渗透压冲击） 高渗溶液（如20%蔗糖、高浓度盐或甘油）中转到冷水中 适合细胞壁脆弱的细胞（动物细胞、革兰氏阴性菌）。 可分离细胞间质蛋白5. 冻融 急冻后室温缓慢融化，反复多次 破坏细胞膜的疏水键，增加其亲水性和通透性； 胞内结晶引起细胞内外浓度变化，细胞膨胀破裂。 破碎率低其他物理方法：研磨（细菌、植物细胞） 旋刀式匀浆（大多数动植物组织） 化学方法1. 酸碱处理 破坏细胞壁和细胞膜，

4、适用于酸碱稳定的产品 如：细菌L-天门冬酰胺酶的提取，将菌体悬浮在pH1112.5的碱溶液中，振荡20min即可。2. 有机溶剂处理 甲苯、丙酮等 溶解脂类物质，增加细胞壁和细胞膜通透性，可实现选择性释放。3. 表面活性剂处理 十二烷基硫酸钠SDS、Triton X-100等 溶解脂蛋白和脂类，作用细胞壁和细胞膜，增加通透性 动物细胞完全破碎 有机溶剂和表面活性剂处理特点： 胞内产物总释放率低，核酸留在胞内，料液黏度低，避免大量细胞碎片，有利于后处理 破碎率低，加入试剂会形成新的污染生物方法1. 酶法 革兰氏阳性菌: 溶菌酶(水解肽聚糖层)； 革兰氏阴性菌： 溶菌酶EDTA 二价阳离子特别是M

5、g2对细胞壁外层具有稳定作用 酵母：溶壁酶(Zymolyase)、葡聚糖酶、甘露糖酶等； 植物细胞：纤维素酶特点：操作条件温和，产物破坏小，费用高肽聚糖溶菌酶(lysozyme): 作用于NAM的G1和NAG的C1-C4之间的糖苷键，所以又称乙酰胞壁质酶。 对G-菌，在EDTA存在下，受溶菌酶作用。溶菌酶处理后的菌细胞应保存在弱高渗（0.1 0.2M）蔗糖液中。图中箭头为溶菌酶的水解点。 溶菌酶的作用过程： /jwc/jpkc/shengji/2007/tangbinweishengwuxue/webpage/epage1.html青霉素(penicillin): 作用于肽聚糖肽桥的联结，即抑

6、制肽聚糖的合成，故仅对生长着的菌有效，主要是G+菌。 菌体细胞壁合成受抑制，可促使胞内产物的分泌/jwc/jpkc/shengji/2007/tangbinweishengwuxue/webpage/epage1.html细胞壁合成抑制三、目标产物的选择性释放目标产物在细胞内的位置：细胞质内细胞器内细胞膜或细胞壁附近（如革兰氏阴性菌周质空间中的蛋白）细胞膜或细胞壁处于结合状态选择性释放：使细胞不完全破碎，选择性释放目标产物，尽量减少其他物质的释放。化学渗透法选择性释放胞内产物流程图 按是否使用外加作用力可将常用的破碎方法分为机械法和非机械法两大类。分 类作用机理适 应 性机械法珠磨法固体剪切作

7、用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程易升温剧烈，不适合大规模操作X-press法固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适应非机械法酶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，酶价格高，自溶法的细胞浆液分离困难化学法改变细胞膜渗透性具有一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差，破碎后需特别除去化学试剂渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其它方法结合使用冻融法反复冻结融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感的目的产物

8、干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活四、破碎率的测定a. 直接测定 利用显微镜观察或计数；染色可将破碎细胞和完整细胞区分开。 如革兰氏染色能将破碎后的革兰氏阳性菌染成阴性菌的颜色； 受损的酵母细胞为亮红色，未受损的酵母细胞为紫色。b. 测定释放的蛋白量或酶活 将破碎后的细胞悬液离心，测定上清液中蛋白浓度或酶活。c. 测电导率 电导率随破碎率的增加而线性增加1、多种破碎方法相结合 化学法与酶法取决于细胞膜壁的化学组成，机械法取决于细胞结构的机械强度，而化学组成又决定了结构的机械强度，组成的变化必然影响到强度的差异，这就是化学法或酶法与机械法相结合的原理。五、细胞破碎的发展趋势2、与上游过程相结合 （1）克隆噬菌体裂解基因 噬菌体裂解基因 举例： 于慧敏等构建得到了一株具有噬菌体裂解基因的产PHB重组大肠杆菌，通过发酵后期升高温度至50保温2h，或者加入螯合剂EDTA，均可使细胞裂解释放出目标产物PHB。图 不同时刻和裂解处理前后的PHB颗粒 （于慧敏，2001年，清华大学博士论文）PHB：聚-羟基丁酸酯，是一种生物可降解塑料 （2）耐高温产品的基因表达 在破碎和分离过程中，为防止产品失活而消耗的制冷费是相当可观的。如果产品能表达成耐高温型，那么在较高的温度