内耳毛细胞离子通道研究进展

内耳毛细胞离子通道研究进展1基金项目：国家自然科学基金资助项目（(309733011基金项目：国家自然科学基金资助项目（(30973301，81271080），重庆市自然基金资助项目（CSTC2009BB5170）※作者单位：400038重庆，第三军医大学附属西南医院耳鼻咽喉-头颈外科通讯作者：袁伟，Email：weiyuan175@蒋晓君※综述袁伟※审校耳蜗毛细胞是听感觉器官的感受器细胞，其顶端纤毛束的偏转，调节细胞内电位，产生感受器电位，这是听觉产生过程中十分重要的环节。因此，离体外毛细胞已成为研究耳蜗听觉生理、生化及病理生理机制的重要实验模型。随着外毛细胞分离技术和电生理技术的发展，尤其是细胞膜片钳技术的应用，为人们了解毛细胞离子通道的开启、关闭和动力学等一系列膜信息，提供了直接手段，使得研究不断深入【1-5】。耳蜗毛细胞和其它细胞一样，其活性要依赖于细胞膜对胞外离子的选择通透性，这种功能的实现是通过离子通道完成的。毛细胞内外不对称的离子环境需要在细胞膜上有各类离子通道存在，因此本研究就毛细胞离子通道的研究进展作一概括。毛细胞顶端离子通道机械—电传导通道(mechano-electricaltransductionMET)及其受体电位。已有人通过三种实验技术证明，机械-电传导的位置是在立体纤毛的顶部【6-8】。第一，通过测量一个受刺激的纤毛束周围的胞外电势的微小变化而推断出阳离子内流进入毛细胞的区域，即电压信号在纤毛束的顶部最强；正离子内流转导通道会聚于立体纤毛顶部附件。第二，可以阻断这些通道的氨基糖苷类抗生素在纤毛束的顶部可发挥出最大的作用。第三，Ca2+敏感性荧光指示剂能够识别出Ca2+在接近偏离的纤毛束顶部的地方进入。每个MET通道由一个膜内在蛋白构成，缺乏离子选择性，碱金属和碱土金属阳离子如Na+、K+、Rb+和Cs+，二价阳离子如Ca2+、Mg2+，小的有机离子如胆碱离子、四乙胺（TEA）均能通过，但稍大些的离子就不能通过，这表明通道直径约为0.7nm。MET通道对阳离子的通透顺序是Li＞Na≥K≥Rb＞Cs＞Choline＞TMA＞TEA，相对于Cs+的离子渗透性,双价离子中Ca2+最大，一定量的极少的Ca2+在转导过程中是必须的，对转导通道的影响是全或无式的。静纤毛上的MET通道通过使K+内流至毛细胞去极化，从而形成受体电位，是毛细胞完成机械—电转导过程的第一步。受体电位使L型电压依赖性钙通道开放，Ca2+内流，作为第二信使，引起毛细胞一系列反应。K+是浸润着纤毛束的内淋巴中浓度最高的正离子。机械刺激引起的静纤毛偏斜通过调节MET通道的开放和关闭过程来控制通过的离子电流的大小，也间接影响受体电位的形成。1.2毛细胞MET通道和底侧膜电压依赖性通道的功能静纤毛之间有两种连接，即顶端连接和侧连接，前者位于静纤毛顶部与相邻较高静纤毛的侧壁之间，后者位于前者之下，使邻近各静纤毛在各个方向连接而使静纤毛集中，作为一个整体接受机械刺激，传导一致的向量。毛细胞纤毛束的偏离启动了机械—电的转导,提示机械力直接控制转导通道的开启与关闭。换言之,机械—电转导的通道是受纤毛束的弹性结构调控的门控式通道[5,7.9]。当静纤毛受到刺激向最长静纤毛方向偏斜时，K+通过静纤毛上的MET通道流入细胞，使细胞去极化，继之又使电压依赖性Ca2+通道激活，Ca2+内流，当胞内Ca2+浓度增加至一定水平，又进一步激活了底侧膜上的Ca2+依赖性K+通道（BK通道），K+随之流出细胞，使膜复极化，Ca2+通道失活；如果静毛束向对侧偏斜，K+从静纤毛上的MET通道外流，膜电位超极化。以后进入胞内的Ca2+被结合﹑缓冲，或被细胞膜上的离子泵或其它转运系统转运至胞外，从而BK通道失活，最后膜电位恢复至静息水平（图一【10】）。MET通道的不敏感性使得它们容易被氨基糖苷类的抗生素阻断。例如：链霉素或新霉素。大剂量使用这些药物，能够破坏毛细胞的纤毛束甚至杀死毛细胞。还有一种学说认为这些药物能够通过转导通道低速潜入细胞内并且通过干涉线粒体中的核糖体上的蛋白合成而转为长期的毒性作用。与这一学说相一致的是，人类对氨基糖苷类的敏感性是作为线粒体的特性遗传而来【11】。毛细胞底侧膜离子通道：迄今在毛细胞底侧膜上已发现的电压依赖性通道有钾离子通道和钙离子通道。Nenov等【12】总结了迄今已发现的几种电压依赖性钾离子通道，包括钙离子激活的钾通道IK（ca）﹑外向延迟整流钾通道（IK）﹑瞬间外向钾通道（Ka通道）、内向整流钾通道（In）。钙离子通道是L型钙通道。钾通道：1.1钙离子激活的钾通道：毛细胞的钙离子激活的钾通道分为大电导（BK）型和小电导（SK）型。BK、SK通道电流激活均依赖于细胞内游离钙离子浓度的升高【13】。生理条件下激活BK通道所需的胞内Ca2+浓度为35μM，豚鼠耳蜗外毛细胞（OHC）的BK单通道电导为220pS。BK通道的激活电压大于-60mV~-45mV，平均开放时间0.08~12ms，通道电导越大﹑细胞静纤毛束越长则平均开放时间越长。Charybdotoxin（蝎毒）是其相对特异性的阻断剂，常作为区分BK通道的工具药。BK通道在靠近蜗底的较矮毛细胞上优势表达。SK通道的特点：单通道、电导低（4~40pS），几乎无电压敏感性，nM级的Ca2+浓度就可激活通道，Apamin是其特异性的阻断剂。在一些组织中，SK通道能被毒蕈碱（乙酰胆碱受体激动剂）激活，通过三磷酸肌醇（IP3）使细胞内钙释放。钙离子激活的钾通道在听毛细胞的机电转换能过程中起着重要作用。已有许多证据表明，在低等脊椎动物，此通道与毛细胞的电共振现象有关，从而产生频率调谐作用【14-15】。由于钙离子激活的钾通道具有快速激活的动力学特性，使毛细胞能够产生高频锁相感受器电位，与基底膜和外毛细胞的敏锐的机械调谐相配合，使哺乳动物的听觉功能更灵敏、频率范围更广。钙离子激活的钾通道与Ca2+内流形成负反馈回路，K+外流使毛细胞复极化，而恢复到静息电位，Ca2+内流终止，从而控制传入突触的递质释放。1.2外向延迟整流钾通道外向延迟整流钾通道具有明显的电压依赖性，膜去极化时激活，不依赖于Ca2+浓度，其单通道电导为8pS，激活电压大于-60mV，激活时间常数为2~100ms。激活和失活缓慢，对4-氨基吡啶相对较敏感，不被Apamin和Ba2+阻断。在靠近蜗顶的较高毛细胞上优势表达。1.3瞬间外向钾通道瞬间外向钾通道的特点是在去极化时快速激活，然后以指数时间过程很快衰减，能被4-氨基吡啶阻断。在豚鼠OHC中，瞬间外向钾通道的电导较小，其携带的瞬间外向钾电流难以从总电流中区分。瞬间外向钾通道的激活电压小于-44mV，激活时间3~7ms，失活电压大于-56mV，失活时间73ms。在电调谐的电压范围内，瞬间外向钾通道是失活的，对膜电导没有贡献。瞬间外向钾电流无Ca2+浓度依赖性。瞬间外向钾通道在鸟类基底乳头中的矮毛细胞上优势表达。矮毛细胞的瞬间外向钾通道在静息电位时完全失活，但胆碱能激动剂能使这些细胞膜电位超极化30mV，这个超极化解除了瞬间外向钾通道的失活状态，使瞬间外向钾通道能够在去极化电压刺激下被激活，在-56～-44mV的电压范围内为细胞提供一个膜电导。在这个电压范围内，其它电压依赖的离子通道是失活的，瞬间外向钾通道的激活可以增加膜电导，降低膜的时间常数，以便毛细胞在传出刺激的抑制性作用之后立即使细胞的膜电位更有利于声信号的输入。1.4内向整流钾通道在豚鼠OHC底侧膜表面的内向整流钾通道首先由Housley和Ashmore报道。此通道在静息电位时就已被激活，膜电位超极化时失活，完全激活电压为-40mV，半量激活电压为-91mV，完全失活电压为-160mV。通道的活性依赖于Ca2+浓度，但不受电压依赖性钙通道的影响。能被Cs+和Ba2+阻断。越靠近蜗底的OHC越优势表达。内向整流钾通道被认为具有K+缓冲的功能，即将内淋巴中的K+转运至外淋巴。另外，越靠近蜗底的OHC，其内向整流钾电流幅度越大，内向整流钾电流使静息电位时的输入电导增加，同时维持跨OHC顶端膜的最大K+驱动力。钙通道目前发现的电压依赖性钙通道分为六型（L﹑T﹑N﹑P﹑Q﹑R型）。存在于豚鼠OHC﹑鸡耳蜗毛细胞底侧膜表面的钙通道大部分为L型。L型Ca2+通道是Ca2+进入毛细胞的重要途径【16】。OHC的钙通道在-30mV时被激活，-20mV时达到峰值。其离子选择性为Ba2+>Ca2+≥Sr2+。能被Cd2+和nifedipine阻断。Ca2+是细胞信号传递的最常见元素。在耳蜗水平，Ca2+的参与能完成以下毛细胞功能。一、Ca2+直接参与毛细胞电携振：Ca2+内流意味着毛细胞激活，Ca2+外流、Ca2+浓度降低则毛细胞恢复至静息电位。二、Ca2+调节毛细胞底侧膜伤钙离子依赖的钾通道。三、Ca2+与OHC的主动运动。四、Ca2+与毛细胞MET的适应（见图一）。五、Ca2+与毛细胞的神经支配。内毛细胞的去极化导致电压依赖性钙通道开放，Ca2+内流，Ca2+浓度升高，从而导致地址的释放。研究与展望复杂的离子通道是内耳毛细胞机械转导的核心。从目前相关研究表明，氨基糖苷类药物、顺铂等化疗药物、利尿剂等药物，之所以能产生耳毒性，首先直接影响毛细胞的离子通道，进而影响毛细胞的传导机制，从而发生听力下降或听力完全丧失的不良反应。由此可见，对毛细胞离子通道及其相应的传导机制研究是未来耳聋治疗药物开发的重要方向。因缺少明确的药理学标记、毛细胞数目的有限性，以及转导机制的特异性等多种因素阻碍着对离子通道分子的进一步识别。如何发现更多的毛细胞通道及其相应的传导机制任重而道远。但随着基因工程学、电生理技术的发展，相信有关毛细胞离子通道的研究在未来几年内可以取得重大的发展。参考文献DavisHA.Mechano-electricaltheoryofcochlearaction.AnnOtol.1958；67：:789HoltonT,HudspethAJ.Thetransductionchannelofhaircellsfromthebull-frogcharacterizedbynoiseanalysis.JPhysiol,1986;375∶195OhmoriH.Gatingprotertiesofthemechanoelectricaltransducerchannelinthedissociatedvestibularhaircellofthechick.JPhysiol,1987;387∶589GitterAH,ZennerHP,FromterE.Membranepotentialandionchannelsinisolatedouterhaircellsofguineapigcochlea.ORLJOtorhinolaryngolRelatSpec,1986;48∶68AshmoreJT,MeechWR.Ionicbasisofmembranepotentialinouterhaircellsofguineapigcochlea.Nature,1986;322∶368KandelER,SchartzJH,JesselTM.Principlesofneuralscience[M].4thed.NewYork:McGraw-HillMedical,2000.591~612,614~624.JaramilloF,HudspethAJ.Localizationofthehaircell'stransductionchannelsatthehairbundle'stopbyiontophoreticapplicationofachannelblocker[J].Neuron,1991,7:409HudspethAJ.Hair-bundlemechanicsandamodelformechanoelectricaltransductionbyhaircells[J].SocietyofGeneralPhysiologistsSeries,1992,47:35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