北京大学单分子与纳米生物学实验室

生物物理学的内容分子生物物理学（MolecularBiophysics)

生物物理仪器与技术(BiophysicalInstrumentationandTechniques)膜与细胞生物物理学(MembraneandCellBiophysics)理论生物物理学(TheoreticalBiophysics)

感官与神经生物物理学(SensoryandNeuralBiophysics)自由基与电磁生物物理学荧光分光光度术Spectrophotofluorimetry一、荧光的发现二、荧光与荧光光谱三、荧光光谱仪及主要谱参量四、荧光生色团的结构特点五、影响荧光测量的因素六、荧光技术在生物学、医学研究中的应用荧光分光光度术夜明珠发光成因

1、矿物的发光性

矿物在外来的能量激发下，产生可见光的性质称为矿物的发光性。外来的能量有日光、紫外线、X射线、阴极射线、加热、加压、摩擦等。根据其发光的性质不同，分为荧光和磷光二类。

2、矿物的发光机理

矿物的发光是矿物能量的一种转换过程，物体受激发吸收能量而跃迁至激发态（非稳定态）在反回到基态的过程中，以光的形式放出能量。

一荧光的发现

1575：N.Monardes

LignumNephriticum1852：Stokes分光计

植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、奎宁借用萤石的（Fluospar）发光现象而推演，荧光Fluorescence1867年：GoppelsroderAL与桑色素的配合测定AL的含量1880：Liebeman

提出“荧光与化学结构关系”的经验法则为荧光技术的开发应用拉开了序幕（一）荧光的产生（二）荧光光谱与吸收光谱二荧光与荧光光谱（一）荧光的产生1分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：Eo=Ee+Ev+ErEe：价电子运动能,electronEv：原子在平衡位置附近的振动,vibrationEr：分子绕其重心的转动能,rotation其中，Ee>Ev>Er（一）荧光的产生2分子的能级EnergyLevels与跃迁Transition（二）荧光光谱与吸收光谱荧光分光光光度术：又称荧光光光谱术，属属于光谱技技术中的一一种发射光谱术术。其原理是电电磁波和物物质作用后后，物质首首先吸收电电磁波的能能量，然后后再重新发发射电磁波波。激发波段在在100-800nm之间，相当当于紫外与与可见光波波段。（一）荧光光光谱仪（二）荧光光分光光度度术中的参参量三荧光光光谱仪与主主要参量（一）荧光光光谱仪吸收光谱仪仪光路图荧光光谱仪仪光路图氢灯的能量量分布氘灯的能量量分布氙灯（红线线）和带有有玻璃外套套的汞灯的的能量分布布1激发光光源在紫外-可可见光区，，可供荧光光激发用的的光源很多多包括：钨钨灯，碘钨钨灯，氢灯，氘灯灯，汞灯，，氙灯等。。主要根据据光源稳定定性和强度度选择光源源。实践中常不不选用强光光源：随着光强的的增加，会会同时导致致散射光和和热量的增增多强光源照射射，容易使使样品产生生光化分解解强光源需要要的稳压稳稳流装置复复杂而昂贵贵产生大量臭臭氧，损害害健康对于光源要要注意以下下几点:（1）正负负极不要接接错。（2）拿拿灯时，不不要碰窗口口，以免手手上的油污污经紫外照照射后，难难以清除。。应及时用无无水乙醇擦擦干净。（3）灯灯有寿命，，要节约使使用。（4）启动间隔一一般要大于于半小时，，待灯冷却却后，在重重新启动。。启动后要预预热半小小时。（5）不不要用眼睛睛直视灯。。2样品池池在可见可用用玻璃池，，但紫外区区一定要用用石英池。。（1）设置置空白对照照。（2）清洗洗问题，关关键是即时时冲洗。自来水冲洗洗SDS浸泡泡双蒸水冲洗洗浓硝酸处理理双蒸水冲洗洗（二）荧光光分光光度度术中的参参量ex—Maximumexcitationwavelengthem,max—MaximumemissionwavelengthA荧光强强度的定义义：在一定定激发波长长(λex)作用下下，发射的的荧光强弱。。F=IaIa=I0-I，I=I010-εcLF=I0(1-10-εcL){当C很低低时F=I0εcL，，{当C较大大时F=I0B=发射光子数数/吸收光光子数2荧光强强度（fluorescenceintensity,F,I））与量子产率（（quantumyield,）（二）荧光光分光光度度术中的参参量荧光强度与与浓度的关关系荧光偏振(fluorescencepolarization)（二）荧光光分光光度度术中的参参量自然光部部分偏偏振光偏偏振光I//-II//+IP=I//-II//+2IA=荧光偏振度度Fluorescencepolarization--p荧光各向异异性Fluorescenceanisotropy--A(1)荧荧光偏振度度的物理意意义：A：I//=I，P=0，，自然光，，荧光分子子运动很快快，取向向随机。。（稀溶液液）B：I//或I为0，P=±1偏偏振光，，荧光分子子运动很慢慢，取向有有序。C：I//I0，，0<P<1，生物物大分子的的荧光属于于这种情况况。(2)环环境因素及及分子运动动对荧光偏偏振度的影影响A.温度度的影响：：溶液粘度A：温度的的影响温温度升高高，P降低低B：溶液粘粘度粘粘度升高，，P升高C：分子的的运动—转转动旋转弛豫时时间rotationalrelaxationtime——（二）荧光光分光光度度术中的参参量4荧光寿命（（Fluorescenceliftime--）荧光衰减为为原来激发发时最大荧荧光强度的的1/e所所需要的时时间I=I0e-kt,=1/k分子所处的的环境有无淬灭有无能量转转移有无分子间间相互作用用影响因素5荧光探探剂具有环状共共轭双键即即π电子系系统量子产率随随环境变化化，而且变变化很大(3)能能产生生稳定荧光光的小分子子藻胆蛋白phycobiliprotein绿色荧光蛋蛋白GreenFluorescentProtein(4)与与研究对象象的特定基基团共价结结合或与蛋蛋白质非共共价结合（5）荧光光探针的应应用分类测定细胞活活性的荧光光探针：活活细胞探针针和死细胞胞探针膜荧光探针针：荧光基基团标记的的磷脂，阴阴离子膜探探针，阳离离子膜探针针，其它非极性性和双亲性性膜探针。。细胞器荧光光探针：线线粒体探针针，溶酶体体、酵母菌菌液泡和其其它酸性细细胞器的探探针Ca2＋，Mg2＋，Zn2＋，Na＋，K＋，Cl－等离子荧光光探针pH荧光探探针:近近中性pH应用的探探针，酸性性，探针交交联物活性氧和一一氧化氮探探针信号转导探探针：蛋白白激酶，蛋蛋白磷酸酶酶和核苷酸酸结合蛋白白探针入胞作用、、受体和离离子通道探探针pH细胞形态和和流体测量量的荧光示示踪剂细胞骨架蛋蛋白荧光探探针四荧光光生色团的的结构特点点1天天然荧光生生色团的结结构特点（1）碳原子子骨架：分子具有共共轭双键体体系，大多多含有芳香香环或杂环环任何有利于于提高π电子共轭度度的结构改改变，都将将提高荧光效率。。例如：对苯苯基化，间间苯基化等等。（2）分子子的几何排排布：具有刚性平平面结构荧光素酚酞四荧光生生色团的结结构特点（4）取代代基的位置置：邻位、对位位—荧光增增强，间位位—荧光减减弱（-CN基例外外））(5)环境境、溶剂、、温度及pH等均会会影响分子子结构，从从而影响荧荧光四荧光生生色团的结结构特点（3）取代代基的类型型：（1）加强强荧光的基基团：给电电子取代基基，-NH2,-NHR,-OH,-OR,-CN,-OCH3,-OC2H5（2）减弱弱荧光的基基团：得电电子取代基基，-CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I（3）影响响不明显的的基团：-R,-SO3H,-NH32蛋白白质和核酸酸中的荧光光生色团Tryptophan(W,Trp)Phenylalanine(F,Phe)Tyrosine(Y,Tyr)四荧光生生色团的结结构特点生色团条件exnmmax10-3emnmFFns敏感度maxF10-2TrpH2O,pH72805.63480.22.611TyrH2O,pH72741.43030.13.61.4PheH2O,pH72570.22820.046.40.08Y-baseYeast-RNAPhe3201.34600.076.30.91亚硝基奈酚酚+Tyr茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Pheex:460nm,em:570nmex:365nm,em:515nm四荧光生生色团的结结构特点五影响荧荧光测量的的因素1光化分分解（photodissociation））光照后导致致化学键断断裂——荧荧光减弱2淬灭(quenching)温度淬灭：：温度每升高高10C，荧光光减少的百百分比，称称为温度系系数。在20-300C的范围内内，温度系系数大约为为1.5。。浓度淬灭：：21内滤光效应应（innerfiltereffect)(3)杂质质淬灭：3O21O23溶液pH的影响响利用一些物物质在不同同pH值溶溶液中荧光光强度和颜颜色的改变变，可以判别各各种滴定的的终点。指示剂颜色变化pH范围萘酚无色变黄绿绿8.2-10.3荧光素浅绿变绿4.0-5.0丫啶橙浅黄绿变黄黄8.0-10.04溶液液极性的影影响荧光物质在在非极性溶溶液中的发发射峰位比比其在极性性溶液中的的峰位向短短波方向（或高频方方向）移动动，即蓝移移，同时荧荧光强度前前者也高于于后者。DPH水溶液中膜中发射波长：：440nm发射波长：：430nm5溶剂和和化学试剂剂(1)溶溶剂选择要要适宜例如：苯、、丙酮、酚酚在紫外波波段有吸收收。(2)溶溶剂要纯纯6荧光光污染(1)涂涂活塞用的的润滑油以以及橡皮塞塞和软木塞塞(2)去去污剂(3)微微生物污染染(4)滤滤纸六荧光分分光光度术术的应用(一）.物物质的检测测1测量量原理：稀溶液，F=I0εcL2结构构特点：含含有“芳香香环”结构构3灵敏敏度：10-7~10-8g/ml检测物质激发波长nm发射波长nm维生素A345490维生素B2，pH7370565维生素B12，pH7275305维生素C4905303,4-苯并芘10-6g/ml3814035羟色胺，中性或弱酸性2953305羟色胺，盐酸295550，330研究生物大大分子构象象（二）蛋白质的荧荧光分析1蛋白质质的内源荧荧光2蛋白质质的外源荧荧光（三）核酸酸的荧光分分析１嘌呤及衍衍生物室温，用紫紫外和可见见光照射，，中性水溶溶液中，均均无荧光。。酸性介质中中，腺嘌呤呤和鸟嘌呤呤有荧光。。碱性介质中中，鸟嘌呤呤有荧光２嘧啶及衍衍生物游离的胸腺腺嘧啶有自自发荧光，，但量子产产率极低Φ＝0.00153核酸的的荧光标记记ProbesexemNoteEthidiumBromide545610非透膜，RNA,DNAPropidiumIodine530615PO-PRO-1iodine435455AcridineOrange490590透膜，RNA,DNAPyroninY545580Bisbenzimide345460透膜，DNA（四）利利用荧光技技术检测分分子间结合合程度1用用荧光偏振振变化检测结合程程度当一些小分分子，如辅辅酶、辅基基、半抗原原等与特异异蛋白质反反应时，改改变其荧光特性性（强度与与偏振），，通过这些些参数的变变化，可以以了解他们们结合时的信息息。结合后的大大分子驰豫豫时间长，，荧光偏振振就大。用杀鼠灵滴滴定HSAScatchard图r=[L]Ka(n-r)[L]=[L0]–[LP]=[L0]–r[P0]λex=320nmλem=400nm2用荧荧光强度变变化检测结结合程度（五）大大分子内基基团间或分分子间距离离的测定荧光共振能能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)荧光共振能能量转移的的三个条件件：供体和受体体都能发光光供体的发射射谱和受体体的激发谱谱必须有部部分重叠供体和受体体的距离必必须小于100ÅForster公公式E=R06/(R6+R06)R0:临界距距离，E：：转移效率率，R：基基团间距离离E=1-IDA/IDIDA:受体存存在时的荧荧光强度，，ID：受体不存存在时的荧荧光强度大分子内基基团间或分分子间距离离的测定1膜流动动性DPH：：P值小，，流动性高高2-AS，，6-AS，9-AS，12-AS高2膜渗漏漏性羧基荧光素素(selfquenching)3膜电位位的测量Nernst公式：：E(mV)=59log(KO+/KI+)KO+：细胞外浓浓度，KI+：细胞内浓浓度荧光探剂：：花菁（cyanine)K+载体：缬氨氨霉素：（六）膜膜生物物理理研究4膜融合合机理的研研究方法一：：利用能量量共振转移移现象λIλI方法二：利利用淬灭现现象1/25膜成成分扩散速速度的测定定荧光漂白恢恢复技术fluorescencerecoveryafterphotobleaching，FRAPD：扩散系系数，ω：：光斑半径径，1/2：：漂白后的的荧光值恢恢复到稳定定值的一半半所需时间，，rD：与光光斑形