siRNA序列搜索课件

siRNA序列搜索RNAi实验所需的4大要素对应目标基因的dsRNA(siRNA,长dsRNA，shRNA载体,看实验需要）；适合的转染或者其他将dsRNA递送进入细胞的方法；适当的对照；检测目标基因表达情况的方法！！！注意：shRNA表达水平未必是越高越好，过表达也有潜在可能导致细胞毒性或者脱靶。三条路线线路1和2均为诱发瞬时基因沉默，持续时间约3－7天，根据目标基因而异，shRNA表达载体则可以建立长效基因沉默的细胞株，进行功能缺失基因组筛选研究，也可用于体内RNAi研究。线路1，蓝色：非哺乳动物细胞中，直接向细胞导入长双链RNA(dsRNA)线路2，红色：哺乳动物细胞中，直接将siRNAs转入哺乳动物细胞线路3，黄色：将短发夹结构shRNA的DNA表达载体转入细胞siRNA的研究结论1研究发现：21-23bp的短dsRNA介导的RNAi效率最高；小于21bp或者25bp的短链RNA效率较低；大于30bp的RNA足以引起干扰素样反应。3’端突出对于RNaseⅢ识别siRNA过程十分关键。siRNA末端的3’的3’-UU突出或3’-TT均可增加siRNA的稳定性，但其它序列未被证明有这样的作用。siRNA的研究结论2使用化学修饰的siRNA介导的RNAi实验显示，正义链的微小修饰如标记荧光探针一般不会影响siRNA的作用效果，但是反义链的微小变化却能降低siRNA的活性。（Chiu和Rana，2002）。如果siRNA反义链的3’-OH标记有一个庞大的FITC荧光基团，siRNA的活性常常会大打折扣。siRNA的研究结论3siRNA的5’-端而不是3’-端的完整性对RNAi十分重要。所以，在解链过程中，siRNA识别具有非对称性特征。（Chiu和Rana，2003）。5-末端’的前十个核苷酸的错配对RNAi效应的影响较大。而siRNA序列3’-端的错配对siRNA活性影响却小的多。此外，5’-端碱基配对的低稳定性对反义链尤为重要，但对正义链的影响不明显。siRNA的研究结论4与siRNA的反义链相似，正义链也可导致非特异性的基因沉默，这些基因至少含有11个与siRNA同源的连续核苷酸，这种沉默作用被称为脱靶效应（off-targeteffect）。通过Smith-Waterman或BLAST搜索可能的靶点，并评价反义序列的特异性，或参考Zamore（Schwarzetal，2003）和Khvorova（Khvor-ova等2003；Reynolds等，2004）提出的新设计原则，我们可以尽量避免脱靶效应。此外，我们还可以设计不对称的siRNA，使得仅仅反义链可以进入RNAi通路。siRNA的研究结论6进一步研究表明，是siRNA的每条链的第2-4个位位置上的单个核苷酸的错配而不是siRNA链的G-U摆动影响了siRNA掺入到RISC这一过程。siRNA设计N21序列的最后两个核苷酸被替换成TT来辅助合成。合成的siRNA反义链与23nt核苷酸的1～21位碱基互补。由于23nt的第1个核苷酸对于沉默作用并不是必须的，siRNA反义链的3’-核苷酸可以换成3’-T。但是23nt的第2个核苷酸应该始终与靶序列互补。siRNA选择标准三、设计合适的对照siRNA——确保数据的有效性阴性对照siRNA：与所选的siRNA核酸组成相同，但与其他基因相比缺乏显著的同源序列。打乱所选的基因特异性siRNA的核酸序列，并进行搜索使其与其他基因无同源性。针对相同基因的其他siRNA：也许是确保siRNA数据的可靠性的最佳途径。siRNAOligo设计原则

1．

希望软件可以在web上使用。即用户可以访问我们的网站，输入基因代码，即可自行在网上设计siRNAOligo。2．

可参照的软件形式：见如下网站：

3．

希望能就每一个所指定的基因找到至少四对以上可合成的双链RNA

oligo。4．

软件设计中的几个关键步骤如下：A．进入GeneBank调出指定基因序列；B．根据特定的一些规则选出一个基因片段；C．再根据一些规则写出正义和反义两段各21个碱基的序列；D．最后通过反转，替代，空格得出最后结果。具体设计原则1．

在所选基因的启动子100个碱基以后开始自5’-端开始2．

寻找基因序列中的23个碱基，最好是5‘-

AA（N19）TT-3’

（N是任何碱基）3．

如果找不到以上AA（N19）TT，则用AA（N21）补足。4．

如果找不到以上AA（N21），则用NA（N21）补足。5．

所选定序列中，G和C的数目的总和在总数（23）的35-55%.6．

满足以上1-5项要求的片段数目如果不足四个，将G和C的数目的总和放宽至总数（23）的30-70%.7．

选好上述序列后，以此确定所需合成双链RNA

oligo的序列如下：8．

正义序列（N19）TT与上述选定的23个碱基序列中的第3-23个碱基相同9．

反义序列的3’----5’的序列与目标序列中的第1-21个碱基互补，即A变成T，C变成G，T变成A，G变成C。10．将反义序列3’----5’改写成5’----3’.11．将最后所得序列中除3’-末端的两个碱基之外的所有碱基中的T都用U来替代。最后每三个组成一个字节，中间断开。12．将所选定的正义序列和反义序列与gene

bank中已知同物种的基因序列进行比较，确定其唯一性（BLAST）具体设计原则13．上述7-10项可见如下例子：假如通过1-5项的条件选出的一段23个碱基的序列是5’-

AAGCTAGTCATGGCCATTGACTT

-3’正义序列就应该是：

5’-

GCTAGTCATGGCCATTGACTT

-3’反义序列就应该是:

3’-

TTCGATCAGTACCGGTAACTG

-5’反转处理后即得：正义序列：

5’-

GCTAGTCATGGCCATTGACTT

-3’反义序列：

5’-

GTCAATGGCCATGACTAGCTT

-3’U替代T以后得到：正义序列：

5’-

GCUAGUCAUGGCCAUUGACTT

-3’反义序列：

5’-

GUCAAUGGCCAUGACUAGCTT

-3’段开字节后最后得到：正义序列：

5’-

GCU

AGU

CAU

GGC

CAU

UGA

CTT

-3’反义序列：

5’-

GUC

AAU

GGC

CAU

GAC

UAG

CTT

-3’“Tuschl”法则Tuschl提出21bp、3’末端带有2个碱基突出的siRNA（正符合Dicer酶切产物的特征）最有效。★新“Tuschl”法则最新一个公布的算法，推荐序列是（N4）A（N6）T（N2）H（N5）W（N2）

N代表任意核苷酸，H不为G，W为A而不是G或C。siRNA序列选择标准标准ⅠG/C含量=30～52%标准Ⅱ在第15～19位核苷酸的位置上有3个或更多的A/U碱基对（正义链）标准Ⅲ发夹结构预测（没有内部重复序列或回文结构）Tm<20℃标准Ⅳ19位核苷酸为A（正义链）标准Ⅴ3位核苷酸为A（正义链）标准Ⅵ10位核苷酸为U（正义链）siRNA序列选择标准避免多个碱基的重复序列，如超过3个鸟嘌呤或包嘧啶以及4个腺嘌呤核苷酸组成的序列。注意！！！多聚鸟嘌呤和多聚包嘧啶核苷酸形成的大互补区可能会干预siRNA的沉默机制；而多聚腺嘌呤通过提前终止转录从而干扰shRNA合成。siRNA序列选择标准避免选择5’-UTR区的序列，因为这个区域的序列包含有阻止靶向识别的蛋白质结合位点，至少要从AUG启动子的第100个核苷酸开始搜索。3’-端可以是合适的靶序列，可特异性防止非必要保守基因的沉默。构建shRNA表达载体shRNA设计，DNAOligo合成，克隆shRNA片段到适当的载体，筛选正确的重组子，测序验证，最后才是shRNA载体转染细胞，检测结果。shRNA序列设计启动子的选择载体类型的选择抗生素筛选标记构建、克隆和测序验病毒表达载体病毒感染细胞的效率远远高于任何转染试剂，对付那些难转染的细胞系，原代细胞，彻底分化的静止细胞等，病毒载体是除电转之外的另一个选择，病毒载体也是动物活体内表达shRNA的手段之一。目前最常用的哺乳动物细胞病毒载体包括：逆转录病毒(Retrovirus)，腺病毒(Adenovirus)，腺相关病毒(Adeno-AssociatedVirus,AAV)，和慢病毒(Lentivirus)。其中逆转录病毒和慢病毒等载体还可以用于构建整合到染色体上的稳定的长期基因沉默细胞株。病毒表达载体在几个病毒体系中，以慢病毒和腺病毒载体最有代表性。慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的几乎全部优点，可以整合到染色体稳定表达，也可以感染包括静止期细胞在内的各种细胞，更优于传统的逆转录病毒。而腺病毒则以游离染色体外做瞬时表达而见长。想要建立长期稳定的shRNA表达细胞株，研究长期基因沉默，逆转录病毒是更适合的选择。★慢病毒shRNA载体慢病毒Lentivirus是逆转录病毒的一种，可整合到染色体上，也很少引发干扰素响应，经过改造后，可以感染几乎任何一种细胞，包括静止期的细胞如神经细胞，因而兼具前面几种病毒载体的优势，优于传统的逆转录病毒。慢病毒转导效率一般90%以上，可以高达100%。不过也要留意染色体上随机插入整合可能导致沉默效果的差异，也可能导致非预期的结果。

shRNA(shorthairpinRNA)

shRNA由siRNA和环状连接序列组成。就是目标siRNA与其反向互补序列之间由特定的连接序列间隔，得到的RNA两端反向互补退火，与连接序列形成茎环结构，类似发夹。携带目标基因shRNA的表达载体转染或者转导到目标细胞中，载体表达shRNA并被Dicer酶切割为siRNA，就可以引发目标基因的沉默。microRNA在自然界的RNAi通路中，microRNA才是真正的主角。这种内源性的非编码区小分子RNA针对3’端非编码区，有着极高的保守性，并在组织中广泛表达，可在转录后以及翻译水平上调控基因表达，可能在不影响mRNA的水平下调控基因表达。

★miRNA与siRNA的区别内源而非外源序列针对非编码区物种进化极为高度保守组织中广泛表达miRNA可能调控多种关键基因可在转录后以及翻译水平上调控基因表达，可能在不影响mRNA的水平下调控基因表达shRNA的免费设计工具Genelink公司shRNADesignersiSearchNCBIshRNA资源库:

设置好参照未转染细胞对照：不加转染试剂的空白对照，用于排除转染试剂对细胞活力的影响（这个可以在摸转染条件时先做）空白对照：只加转染试剂(如果实验用到载体则可做一组空载体对照)，用于排除siRNA转染对细胞活力的影响负对照：设置不针对目标细胞内源任何基因的siRNA对照，用以排除转染siRNA对基因表达可能造成的任何非特异影响。正对照：设置针对易于检测的参照基因的siRNAs，用于确证siRNAs的递送、转染以及反应条件环境是可行的。也有建议选择和目标基因同一信号通路的另一个基因作为参照，便于排除脱靶等副反应，以及进一步确认目标基因的功能。SchematicofaTypicalHairpinsiRNA

theloopformedby“UUCAAGAGA”seemstohaveahigherefficiencythanloopsformedbyothersequencesInsertDesignforpSilencer1.0-U6.ThisinsertisspecificforthepSilencer1.0-U6Vectorandcontainstheappropriate3'overhangsfordirectionalcloningintothisvector.Theloopsequenceandlengthcanbevariedasdesired.ForcloningintothepSilencer1.0-U6vector,nucleotideoverhangstotheEcoRIandApaIrestrictionsitesareaddedtothe5'and3'endoftheDNAoligonucleotides,respectivelyInsertDesignforpSilencer2.0-U6andpSilencer3.0-H1.TheinsertdesignisspecificforthepSilencer2.0-U6,2.1-U6,3.0-H1and3.1-H1ExpressionVectorsandcontainstheappropriateoverhanging5'endsfordirectionalcloningintotheseplasmids.AswithpSilencer1.0-U6showninFigure2,earlyindicationssuggestthatagreatdealoflatitudeispossibleinthedesignoftheloop;hereweprovideoneloopsequencethatwefindworkswell.siRNA设计软件

（跟blast不同算法）

(港大)

（友好，文献支持，可视性强）

（whitehouse,多人赞）

...2/index.php?type=fc

（避免offtarget效应在BLAST方面，siDIRECT有独到之处）

（ambion公司，简单，有blast链接）

公司

RationalsiRNADesign

（excel做的siRNA设计模板）

★如何维持实验室无RNase污染经常定期处理各种表面，防止RNase污染实验全程戴手套，一旦手套触及其他表面立即更换加样枪专用选择无RNase污染的指管枪头和试剂减少RNA实验区通风或者空气流动。▲RNA聚合酶III启动子多数siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III启动子(polIII)中的一种，操纵一段小的发夹RNA在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNApolIII启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的polIII启动子下游。这个过程需要较长时间，也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。

◆启动子的选择shRNA的表达产量取决于启动子的强弱U6启动子比H1强，而且表达持续时间较长，是多数人的首选。除此之外，RNA聚合酶II类的启动子如CMV启动子和U1启动子也比较常见。当你的shRNA序列有连续的U/T

时应该优先考虑CMV启动子载体。上述的启动子都是组成型表达的启动子，在人源，小鼠或者大鼠细胞中都能通用。◆启动子的选择选用U6启动子载体时，设计shRNA要避免连续3个以上的U或者A，以防提前转录终止而得不到预期的shRNA。切记！！

含U6启动子的表达框是由内源性的U6启动子和前27nt的核苷酸组成的嵌合体，即U6snRNA（U6+27）。☆抗生素筛选抗生素筛选本来不是必须的，有人甚至觉得会干扰细胞原有的表达模式。不过有抗生素筛选能得到稳定表达shRNA的细胞株，便于长时间研究RNAi；而且可以有效避免未转染细胞影响后继的mRNA检测。抗生素选择的另外一个作用是促进shRNA表达，防止shRNA表达减弱而影响基因表达沉默的效果。所以，如果有，还是选一个抗性标记比较好。实验结果分析由于RNA干扰首先表现在mRNA水平降低，其次是蛋白质水平的降低，然后才是表型或者功能的变化。所以最简单通用的方法首先就是转染后24-48小时做定量RT-PCR，检测mRNA的水平。其次是通过WesternBlot或者免疫印迹，流式等方法检测蛋白质水平的下降。实验结果分析由于和siRNA关系密切的microRNA可以在不影响mRNA水平的情况下在翻译水平上抑制蛋白的表达，所以，在检测mRNA水平之余，多数研究人员同意需要检测蛋白质水平的下降。如果你的siRNA实验中检测不到明显的mRNA水平下降而又检测到蛋白水平的下降，那么可以推测该siRNA以microRNA的作用方式调控蛋白表达。检测mRNA水平要检测mRNA水平，首先要纯化细胞RNA。其次是做荧光定量RT-PCR。