生理学实验的一般操作方法

生理学实验的一般操作方法一．生理学实验方法概述生理学实验一般可分为急性实验法和慢性实验法两大类。急性实验法是在无痛条件下剖开动物身体，对某一两个器官进行实验观察。实验过程不能太长，试验后将动物处死。它又可分为两种：（1） 离体实验法将要研究的器官或组织从活的或刚处死的动物上取出，置于接近正常生理条件的人工环境中，以观察、研究其生理机能。如离体蛙心灌流等。（2）在体实验法动物在麻醉或毁坏脑或脊髓的状态下，用手术的方法暴露某一器官，观察、研究其机能及变化规律。如心搏过程的观察、小肠运动的观察等。慢性实验法在无菌条件下对健康动物进行手术，暴露要研究的器官或摘除、破坏某一器官，然后在接近正常生活条件下，观察所暴露器官的某些功能、以及摘除或破坏某器官后所产生的功能紊乱等。实验动物的固定在手术过程中，必须将麻醉动物进行固定，以限制动物的活动，保证实验或手术的利进行。常用的固定方法有两种：背位固定法将动物的背部直接接触手术台的固定方法。在呼吸、循环、消化、泌尿等试验中均采用此法。腹部固定法将动物的腹部直接接触手术台的固定方法。这种固定法适用进行脑脊髓的实验。实验动物的麻醉为了使动物在实验过程中保持安静，不挣扎，必须对动物进行麻醉。麻醉的深浅可以从呼吸、某些反射的消失、肌肉的紧张程度和瞳孔的大小等加以判断。一般用夹捏后肢股部肌肉以观察其反应的简易方法了解动物的麻醉深度。（一） 常用麻醉药麻醉药可分为局部麻醉剂和全身麻醉剂两种。在生理实验中，常采用全身麻醉法，如挥发性的乙醚和非挥发性的巴比妥类、水合氯醛等。（二） 麻醉药的给药途径和方法非挥发性麻醉药的给药途径为注射给药法，主要有静脉、腹腔、肌肉、皮下和淋巴囊注射。.静脉注射：兔的部位为耳缘静脉，兔耳的外缘血管为静脉，中央的血管为动脉。注射前，先剪去注射部位的被毛，用左手食指和中指夹住耳缘静脉近心端，使其充血，并用左拇指和无名指固定兔耳。用左手持注射器将针头顺血管方向刺入静脉，刺入后再将左手食指和中指移至针头处，协同拇指将针头固定静脉内，便可缓缓注射。如注射阻力过大或局部肿胀，说明针头未刺入血管，应拔出重新刺入。首次注射应从静脉的远心端开始，以便进行反复注射。.腹腔注射：先剪去腹部的被毛，右手将注射器刺入下腹部腹白线稍外侧处，注射器与皮肤呈45°夹角，若针尖通过腹肌后抵抗消失，应保持针头不动，轻轻注入麻醉剂。腹腔注射应防止把针头刺入肠、肝、膀胱等内脏器官，因此针头刺入后须轻轻回抽，如无肠内容物、尿液或血液被抽出，说明针头未刺入内脏。肌肉注射：常用来麻醉禽类，注射部位多为胸肌或腓肠肌等肌肉较发达的部位。固定动物后，右手持注射器，使之与肌肉呈60°夹角，一次刺入肌肉。注射完毕后用手轻轻按摩注射部位，帮助药液吸收。皮下注射：在注射麻醉中并不常用，注射时可将皮肤拉起，注射针刺入皮下，然后注入药物。表1： 动物常用麻醉剂的剂量和用法麻醉剂动物种类给药途径剂(mg/kg量体重）药物浓度%乙醚各种动物气管吸入适量狗、猫、兔静脉30腹腔35戊巴比妥纳鼠类腹腔403禽类肌肉50〜100狗、猫、兔静脉1000腹腔1000氨基甲酸乙酯鼠类腹腔100020〜25禽类肌肉1250蛙类淋巴囊2000狗、猫静脉80〜10010腹腔100〜15010水合氯醛静脉50〜755兔腹腔35010皮下5007四．实验动物的局部解剖（一）颈部手术1.气管分离术将动物背部固定，剪去颈部腹面的毛，用手术刀在紧靠喉头下部沿颈部正中线切开皮肤5〜7厘米，在气管正腹面用手或用止血钳分层分离皮下结缔组织，即露出胸骨舌骨肌。用止血钳把正中线的胸骨舌骨肌分开，即可暴露气管。颈总动脉分离术颈总动脉位于气管外侧，腹部被胸骨舌骨肌和胸骨甲状肌所覆盖。分离时，可用左手拇指和食指捏住已分离的气管一側的胸骨肌,再稍想外翻,即可将颈总动脉以及神经束翻于食指上。用玻璃分针轻轻分离动脉外侧的结缔组织，便可将颈总动脉分离出来，最后穿线备用。神经分离术在分离颈总动脉的基础上，提起动脉，即可看到粗细不同的神经，兔颈部血管神经束内有3条粗细不同的神经，其中迷走神经最粗，呈白色，一般位于外側；交感神经稍细，略呈灰色，一般位于内側；减压神经最细，位于迷走和交感神经之间。（二）腹部手术在动物实验中，腹白线是腹部切口的常用部位。腹白线是位于腹中线下面的白色腱膜线，从胸骨的剑突隆起直至耻骨联合。腹白线为较宽的结缔组织间层，神经血管分布极少。因此，通过腹白线所作的腹正中切口，不伤及肌肉、神经和血管，对动物损伤较小，较少出血。血液的组成及红细胞比容的测定目的：通过本实验学习测定红细胞比容的方法，了解血液的组成。原理：全血中红细胞所占的容积百分比，称为红细胞比容。血液由血浆和血细胞组成，将抗凝血放在有刻度的比容管中，用离心沉淀的方法使血细胞与血浆分离。红细胞下沉，彼此压紧而又不改变每个血细胞的正常形态，这样就可以计算出红细胞在全血中所占的容积百分比。实验器材：温氏比容管、长注射器、离心机、抗凝血等。方法及步骤：用长注射器吸取抗经血，然后将注射器插入温氏比容管内，缓缓地将血液注入比容管中，使血液准确地装到刻度10厘米处。离心：将温氏比容管放入离心机中，以每分钟3000转的速度离心30分钟，取出比容管观察，其上层为血浆，下层红色部分为红细胞，血浆与红细胞之间有一白色薄层为白细胞和血小板。记录红细胞所占容积的数值，然后再以3000转速度离心5分钟。如红细胞的容积与上次相同，表明红细胞已被压紧。读数即为红细胞比容（如两次离心读数不同，则以同法继续离心5分钟，直至相同为止）。注意事项：1.离心后，如红细胞表面是斜面，则读数取倾斜部分的平均值。装抗凝血的试管应用塞塞紧，防止血浆内水分蒸发，影响红细胞比容。血红蛋白测定目的：把学习用比色法测定血红蛋白的方法。原理：测定血红蛋白的方法较多，实验常用比色法。其原理是在一定量的血液中加入一定量的血液的稀盐酸，血红蛋白与盐酸作用后，能是亚铁血红素变成高铁血红素，呈现较稳定的棕色。用水稀释后与标准比色板比较，可求出每100ml血液中所含的血红蛋白克数。实验器材：血红蛋白计（标准比色架、血红蛋白稀释管）、玻棒、血红蛋白吸管、滴管、采血针、1/10盐酸、酒精棉球、95%酒精、乙醚、蒸馏水等。方法与步骤：.用滴管加1/10N盐酸于血红蛋白稀释管内，到刻度“2”处。.用酒精棉球消毒动物的采血部位，待其干燥后，用消毒过的采血针刺破血管，使血液流出，第一滴血弃去不要，待第二滴血流出时，用血红蛋白吸管的尖端接触血滴，吸血至刻度20mm3处。用滤纸片擦干吸管周围的血液，将吸管插入血红蛋白稀释管的盐酸内，轻轻吹出血液至管底部，反复吸入并吹出稀释管内上层的盐酸，洗涤吸管多次，使吸管内的血液完全流入稀释管内，注意避免起泡，用玻棒搅匀后，放置10分钟。把稀释管插入比色架中，使无刻度的两侧面位于空格的前后方，便于比色。用滴管向稀释管内逐滴加入蒸馏水（每加一滴要搅拌），边滴边观察颜色，直至颜色与标

准比色柱相同为止。稀释管上液面的刻度读数即为每100ml血液中血红蛋白的克数。注意事项：.血液与盐酸作用时间不可少于10分钟，否则血红蛋白不能充分转变成高铁血红蛋白，使结果偏低。.比色时应将玻棒取出，而且最好在自然光下，而不应在黄色光下进行，以免影响结果。整个实验过程中均应注意避免起泡。红细胞沉降率的测定目的：了解红细胞沉降的原因并掌握沉降率的测定方法。原理：从血管中抽取一定量的血液，经抗凝处理后，放入有刻度的血沉管中，直立静止一段时间，可见红细胞因比重较大而逐渐下沉。在单位时间内红细胞下沉的速率，称为红细胞沉降率，简称血沉。它是以血浆层的高度来决定，血浆层越高，表示沉降率越快。在临床上某些疾病可引起红细胞沉降率的显著改变，故测定红细胞沉降率具有临床诊断价值。实验器材：抗凝血、血沉管、血沉台、3.8%柠檬酸钠、小试管、注射器、针头等。方法及步骤：将抗凝血吸至血沉管内，恰好吸至刻度“0”处。然后擦去血沉管外面的血液，垂直地固定于血沉台上。固定后，立即开始计算时间，分别在15分钟，30分钟，45分钟，1小时，2小时检查血沉管上部血浆柱的高度，以毫米表示之。注意事项：.本实验用的血液与抗凝剂的容积比列规定为4：1。.自采血时起，本实验应在2小时内完毕，否则会影响结果的准确性。.小试管、血沉管、注射器、针头等均应清洁干燥。沉降率随温度的升高而加快，故应在室温22-270C时测定为宜。呼吸运动的调节目的：了解呼吸运动的记录方法，观察各种因素对呼吸运动的影响，并分析其作用机制。原理：正常的呼吸运动由于受到体内神经和体液因素的调节，能够有节律地进行，并能适应机体代谢的需要。体内外各种不同因素可通过神经与体液途径，对呼吸运动产生影响。实验动物：家兔实验器材：MS-302型生物信号记录分析系统、电子刺激器、保护电极、手术台、手术器械、玻璃分针、线、气管套管、胶管、水合氯醛、3%乳酸、CO2气球、注射器、注射针头、铁支架、双凹夹等。方法与步骤：1，将兔麻醉后背位固定在手术台上。2，在颈部分离出气管两侧的迷走神经约2CM长，各穿一条线备用。3，用玻璃分针分离出气管(在第三气管环以后，约1CM长)，在气管下穿一条线备用。用虹膜剪于2-3气管环之间剪一“T”形切口，用小棉球深入切口内除去气管内分泌物及血迹，以防窒息。4，从“T”形管切口处插入气管套管，用备用线结扎,并将线套侧管上固定，以防套管滑脱.将套管的一端侧管套上压力换能器.5，仪器连接及应用开机,进入MS-302系统.通道选择:分别将1、3通道选为“无输入”，2通道选择为“呼吸”，将压力换能器的输出连至第2通道。打开“打印选择”菜单，选择打印通道后，按Esc键退回。进入“记录状态”，依次进行每个实验项目，按空格键暂停，按F9打印结果。6，描记一段正常的呼吸曲线。7，将CO2气球出口与气管套管的另一端侧管靠近，使兔吸入CO2，观察呼吸曲线的变化。8，使兔缺氧，观察呼吸曲线的变化。9，将气管套管的另一端侧管连接一段大约50CM长的胶管，使无效腔增大，观察呼吸曲线的变化。10，从耳缘静脉注入3%的乳酸0.5mL,观察呼吸曲线的变化。11，提起一侧迷走神经的备用线，剪断迷走神经，观察呼吸曲线的变化。再将另一侧迷走神经的备用线结扎并剪断，观察呼吸曲线的变化。剪去腹部之毛，自腹中线剪开，推开腹腔脏器，露出膈肌，注意膈肌收缩及其位置变化与呼吸运动的关系。注意事项：1，实验时须注意比较每作一项实验前后呼吸曲线的变化。2，注射乳酸时注意不让乳酸从静脉中漏出，以免兔子因疼痛而挣扎，影响实验结果。反射弧的分析目的：通过本实验分析反射弧的组成部分，了解反射弧的完整性与反射活动的关系。原理：反射弧由感受器、传入神经、神经中枢、传出神经、效应器五部分组成。反射弧的结构与功能的完整是实现反射活动的必要条件，反射弧的任何一部分受到破坏，均不能出现放射活动。实验动物：蛙或蟾蜍实验器材：手术器械、玻璃分针、线、蛙板、电子刺激器、铁支架、双凹夹、棉花、培养皿、滤纸、保护电极、普通电极、0.5%和1%硫酸、1%可卡因或乙醚等。方法及步骤：.制备脊蛙或脊蟾蜍：用探针捣毁蛙或蟾蜍的脑髓，用一小棉球塞入创口止血。.用小镊子将蛙或蟾蜍的下颌穿一小孔，然后穿一条线，将其悬挂在铁支架上。用培养皿盛0.5%硫酸，将蛙一侧后肢的中趾趾端浸入，该侧后肢立即出现屈腿反射。迅速以清水洗净脚趾硫酸，并用布轻轻擦干。用剪刀在同侧(指硫酸刺激的那一侧)跟腱部位将皮肤做一环形切口，并将其下部皮肤剥掉，在以上述方法刺激，观察有无反射出现。将浸过硫酸的滤纸片贴在剥皮肤的股部皮肤上，观察有无屈腿反射？在另一侧后肢股部的背侧，沿坐骨神经的行走方向将皮肤作一纵形切口，将坐骨神经分出，并在神经下面穿一条线备用，将该侧中趾的趾端进入盛有0.5%硫酸的培养皿中，观察到屈腿反射后，提起放在坐骨神经下面的备用线，用蘸有1%可卡因或乙醚的小棉球置于神经干下，约半分钟后，再以同样方法刺激该侧中趾趾端，观察有无反射出现？如果仍有反射出现，则每隔半分钟刺激一次，观察反射是否消失？当反射刚刚消失时，迅速以浸有1%硫酸的小块滤纸贴于该侧躯干部的皮肤上，观察有无反射出现？如有反射，则每隔1分钟刺激一次，观察反射是否消失？当反射消失后，拿掉蘸有可卡因或乙醚的小棉球，并迅速用任氏液反复冲洗坐骨神经，再以同样方法刺激该侧中趾趾端（或采用电刺激），观察是否恢复？如未恢复，继续用任氏液冲洗坐骨神经，并放置一段时间，再观察反射的恢复。.待反射恢复后，增大电刺激强度，在刺激该侧中趾趾端,观察对侧有无屈腿反射你？.用探针插入脊椎管，上下搅动以破坏脊髓，再刺激身体任何部位，观察有无反射出现？注意事项：1.捣毁脑组织时不能损伤脊髓。每次用硫酸刺激的时间不宜过长，以免烧伤皮肤。用硫酸刺激后，必须立即用清水洗去硫酸，并用布擦干。脊髓反射目的：观察脊髓反射的基本特征、兴奋在中枢神经系统内传导的基本特征，以及脊髓在维持肌紧张中的作用。原理：中枢神经系统活动的基本方式是反射。每一反射均有其固定的反射弧，并与其他反射相互协调。兴奋在中枢内传导时有总和、扩散、后作用及抑制等特征；脊髓是维持肌紧张的基本中枢，而且，脊髓是中枢神经系统的最低级部位，它的机能最简单，便于观察。实验动物：蛙或蟾蜍实验器材：手术器械、玻璃分针、线、蛙板、电子刺激器、铁支架、双凹夹、棉花、培养皿、纸、保护电极、普通电极、0.5%和1%硫酸等。方法及步骤：1.观察脊髓反射活动的特征：制备脊蛙或脊蟾蜍，将其悬挂在铁支架上，进行下列实验：（1） .屈肌反射与对侧伸肌反射：用0.5%硫酸进入一侧后肢中趾趾端，可见该侧后肢屈曲，而对侧后肢伸直。（2） .搔扒反射：以浸有0.5%或1%硫酸的小滤纸片贴于蛙或蟾蜍的一侧腹部，可见其同侧后肢抬起，向受刺激的部位搔扒。2．兴奋在中枢神经系统内传导的特征：（1） .反射作用的抑制：用0.5%或1%硫酸测定反射时，然后用镊子夹住蛙或蟾蜍一侧大腿根部的一部分皮肤（夹的力度要适当，不要太大），待动物安静后，再用0.5%或1%硫酸测定反射时，比较二者有何区别？（2） .刺激的总和：将普通电极的两极置于一侧后肢某处，选用单个刺激，并调节至阀下刺激强度，反复刺激，观察有无反射发生？（3） .兴奋的扩散：选用连续刺激，刺激蛙或蟾蜍的一侧后肢某处，调节刺激强度逐渐由弱到强，观察在强电流刺激下，其反应部位有无增加？（4） .兴奋的后作用：用电刺激蛙或蟾蜍的一侧后肢某处，观察在刺激停止后，反射活动是否立即停止？3．脊髓在维持肌紧张中的作用：实验蛙的四肢一直处于某种程度的委曲状态，这说明肌肉处于某种程度的紧张状态，若用探针插入脊椎管内，上下搅动，将脊髓破坏后，则肌肉松弛，四肢完全下垂。注意事项：在每次刺激之间应间隔3-4分钟，其余同实验二十五。胰岛素惊厥目的：通过本实验观察注射胰岛素对动物血糖水的调节作用。原理：胰岛素是调节机体血糖水平的激素之一。给动物注射大量胰岛素后，引起血糖降低，动物出现惊厥现象。实验动物：小白鼠或家兔。实验器材：注射器、胰岛素溶液、50%葡萄糖、酸性生理盐水、0.01%肾上腺素、20%葡萄糖等。方法与步骤一：取4只体重相近的小鼠，分为实验组与对照组，每组2只。给实验组小鼠腹腔注射胰岛素溶液（0.1毫克/10克体重），胰岛素溶液浓度为2国际单位/毫升。给对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水。将两组动物做好标记后，放在室温下观察，比较两组动物的神态、姿势及活动情况。当动物出现抽搐，翻滚等惊厥反应是，记录时间，并将其中一只立即皮下注射50%葡萄糖（0.1毫升/10克体重）。比较对照组动物、注射葡萄糖的动物、以及出现惊厥而未经注射葡萄糖的动物的活动情况，分析所得结果。注意事项：.动物在实验前必须饥饿18-24小时。.用pH2.5-3.5的酸性生理盐水配置胰岛素。酸性生理盐水配置：将10毫升0.1NHCL加入300毫升生理盐水中，调pH值为2.5-3.5.若实验在冬天进行，注射胰岛素后，最好将动物放在30-370C环境下保温，以加快反应的出现。方法与步骤二：.取事先经过饥饿24-36小时的家兔二只，称重后从耳缘静脉注射胰岛素10-20国际单位/公斤体重。.约1小时后，观察动物有无不安、呼吸急促、惊挛，甚至休克现象。3.待上述低血糖症状出现后，给甲兔即使静脉注射20%葡萄糖20毫升，给乙兔及时皮下注射0.01%肾上腺素（0.3-0.4毫升/公斤体重），仔细观察实验动物，并记录试验结果。摘除动物肾上腺的观察目的：学习用器官摘除法造成功能缺损，从而研究内分泌腺生理功能的方法：观察动物被摘除肾上腺后，对其生理机能的影响。原理：肾上腺分皮质和髓质两部分。肾上腺皮质分泌糖皮质激素、盐皮质激素和少量性激素。糖皮质激素参与调节体内糖、蛋白质、脂肪的代谢，并能增强机体对有害刺激的耐受能力；盐皮质摘除肾上腺后，动物表现出肾上腺皮质功能失调的现象，例如食欲降低、低血压、肌无力、肾衰竭等，同时也表现出抗炎症、抗过敏能力下降及对有害刺激的耐受力下降等。实验动物：小白鼠或大