细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座

1.掌握离心技术原理及离心机使用；2.熟悉提取分离细胞核、细胞质方法；3.熟悉判定核酸方法；

细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第1页

一、分离细胞质与细胞核

１.破碎细胞细胞破碎方法机械法高速组织捣碎机玻璃匀浆器研钵物理法超声匀浆器冻融法化学法自溶法酶处理表面活性剂处理法细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第2页细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第3页利用各细胞器在一定介质中沉降速度差异，可采取离心方法，将细胞器分离出来。２.离心技术细胞器沉降先后次序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其它微体、核糖体和大分子。细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第4页离心方法差速沉降离心法

速率区带离心法等密度区带离心法密度梯度区带离心法

√√细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第5页差速沉降离心法(differentialcentrifugation)采取逐步增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不一样颗粒，在不一样离心速度及不一样离心时间下分批分离方法。

加速低速高速细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第6页

差速沉降离心法普通用于分离沉降速度相差较大（普通为10倍）颗粒。

缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，尤其是当颗粒很大或浓度很高 时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗 粒变形、聚集而失活。

细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第7页每种纯样品成份在介质溶液中沉降速度能够表为：V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r。V：是某一时刻样品沉降速度（厘米/秒）；d：样品颗粒直径（厘米）；σ：样品颗粒密度（克/厘米3）；s：介质溶液密度（克/厘米3）；η：介质溶液粘性系数（克/厘米·秒）；ω：离心机重轴旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分；r：颗粒所在位置与旋转轴心之间距离，即离心半径（厘米）；密度梯度离心法理论依据细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第8页待分样品沉浮行为怎样确定？当σ>S时V>0即样品顺离心力方向沉降

σ<S时V<0即样品逆离心力方向上浮

σ=S时V=0即样品停顿沉降或上浮，“稳定”在这一位置

用这个公式能够很好地解释在速率区带离心法或等密度区带离心法中单一样品沉降（或上浮）行为。细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第9页速率区带离心法人为地加入不一样密度活性物质，形成一个较为平缓介质梯度，将样品加在介质中进行离心，在一定离心力下依据颗粒沉降速度不一样最终分配到梯度中一些特定位置上，形成不一样区带分离方法。

此法用于分离含有一定沉降速度差颗粒（沉降速度差为20%或更少）或分子量相差3倍蛋白质。适合用于分离密度相同而大小有别样品。细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第10页样品在密度较高、密度梯度较为陡峭介质溶液中进行离心，含有不一样密度颗粒向上浮起，一直移动到与它们密度相等等密度点特定梯度位置上，形成几条不一样区带，这就是等密度区带离心法。

等密度区带离心法此方法适合用于分离大小相近而密度不一样样品。细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第11页优点：a.分离效果好，可一次取得较纯颗粒。b.适应范围广,能象差速离心法一样分离含有沉降 系数差颗粒,又能分离有一定浮力密度差颗粒。c.颗粒不会挤压变形。缺点：a.离心时间较长；b.需要制备梯度；操作严格，不易掌握。密度梯度区带离心法(densitygradientcentrifugation)细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第12页

1、核酸种类及其分布请思索？

DNA、RNA在细胞中分布：DNA胞核内(98%)胞质内(2%)RNA胞核内(10%)胞质内(90%)

核酸种类：DNA、RNA结论：DNA主要存在于细胞核，RNA主要存在于细胞质。二、核酸判定细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第13页

2、核酸水解核酸

核苷酸

磷酸

碱基

戊糖

定糖法（戊糖差异）细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第14页（1）核糖核酸判定浓HCl＋3H2O+

β－

D－核糖

糠醛

糠醛

3，5－二羟基甲苯

绿色化合物

RNA

ＯＨˉ

水解

β－

D－核糖

细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第15页（2）脱氧核糖核酸判定DNAＨ＋

水解

β－D－２－脱氧核糖-H2O硫酸脱氧核糖

ω－羟基－γ－酮基戊醛蓝色化合物细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第16页（1）分离细胞质与细胞核（1）分离细胞质与细胞核（2）核酸判定细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第17页0.5g肝组织＋少许石英砂研磨加5ml1.5%柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤

肝匀浆，倾入离心管离心：3000r/min；10′上层液沉淀加入1ml0.25mol/L蔗糖柠檬酸溶液

核悬液沿壁缓铺于8ml

0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上离心：r/min；5′上层液（弃去）沉淀核洗液5ml洗涤沉淀，离心：r/min，5′上层液（弃去）沉淀初步纯化细胞核

5ml0.02mol/LNaOH溶解细胞核待测样品判定实验流程图细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第18页

编号12细胞质（滴）20-核液（滴）-201mol/LKOH（滴）20202．判定：取试管三支，编号，按下表操作:编号123细胞质水解液（滴）20--核液水解液（滴）-20-5％三氯醋酸（滴）1010303,5一二羟基甲苯液（滴）3030301.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：（2）核糖核酸判定混合各管沸水浴(10′)冷却加入5%三氯醋酸(8ml)搅匀后离心

r/min；5′上清液

马上混合各管沸水浴(10′)冷却比较各管颜色

细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第19页

2．判定：取试管三支，编号，按下表操作:1.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：编号12细胞质（滴）20-核液（滴）-201mol/L过氯酸(滴）2020编号123细胞质水解液（滴）20--核水解液（滴）-20-1mol/L过氯酸（滴）20二苯胺试剂（滴）202020（3）脱氧核糖核酸判定混合各管冷却离心

上清液

马上混合各管冷却比较各管颜色

r/min;5′细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第20页表1.核糖核酸判定试管编号123现象试管编号123现象表2.脱氧核糖核酸判定细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第21页1．规范操作，预防滴管、试剂污染。细核悬液平铺要轻柔；浓酸取用要小心；使用离心机注意平衡，转速从低到高；细胞核的分离与核酸的鉴定专题知识讲座第22页思考1.本试验结束后若想继续测定肝脏中DNA、RNA含量，可用什么方法？2.我们已经学习了电泳法和层析