免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计

HRP标识单抗建立Elisa夹心法测定对应抗原含量

汇报人：闫斯楠

时间：13.7.6免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第1页一、CEA介绍大肠癌组织可产生一个糖蛋白，作为抗原引发患者免疫反应。此种抗原称为癌胚抗原（carcino-embryonicantigenCEA），可广泛存在于内胚叶起源消化系统癌，也存在于正常胚胎消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反应出各种肿瘤存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌疗效判断、病情发展、监测和预后预计是一个很好肿瘤标志物。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第2页二、方案设计常规夹心法CEA抗体1-抗原-CEA抗体2-二抗（HRP标识）免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第3页本试验夹心法CEA抗体1-抗原-CEA抗体2（HRP标识）该方案是直接法与夹心法有效结合，兼具二者优点。为当前市面上Elisa检测试剂盒通用发法。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第4页三、主要技术方法双抗夹心法ElisaHRP标识CEA单抗2Sephadex

G-25层析法免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第5页1.

Elisa

A.试验步骤：1.抗原预包被。用包被缓冲液将抗原稀释（浓度由预试验确定），每孔加入200微升，37℃孵育1小时后，4℃放置16-18小时。2.洗涤。倒尽板孔中液体，加满洗涤缓冲液，静止3分钟后倒掉。重复3次，最终一次尽可能拍干板孔中剩下液体。3.加封闭缓冲液每孔200微升，37℃放置1小时。4.同2步洗涤。5.加被测血清100微升（做梯度稀释），并作阳性、阴性及空白对照。37℃放置1小时或者4℃过夜。6.同2步洗涤。7.加二抗。50微升每孔加入适宜浓度二抗，37摄氏度放置1小时。8.同2步一样洗涤，并多重复一次，最终一次重复后一定要排干全部水分，不然会有假阳性出现。9.显色。每孔加入底物溶液100微升，室温暗处放置10-15分钟，然后用终止液终止显色。10.酶标仪读数。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第6页B.需要配制试剂1.包被缓冲液：0.05MpH9.6碳酸缓冲液，4℃保留Na2CO30.15gNaHCO30.293g稀释至100ml2.洗涤缓冲液：0.01MpH7.4PBS-Tween-20，室温保留NaCl8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O2.9g或者Na2HPO41.15gTween-200.5ml(用前暂时加入)稀释至1000ml3.封闭缓冲液：在洗涤缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者10%BSA或者0.5%鸡卵清蛋

白。（用时现配）4.稀释缓冲液：在洗涤缓冲液中加入0.1%BSA。（用时现配）5.显色终止液：2MH2SO4，室温保留

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml，并边加入边混匀。6.底物缓冲液：pH5.0磷酸棗柠檬酸，4℃保留Na2HPO47.298g

柠檬酸4.669g加水至1000ml7.底物溶液：TMBS底物使用液（用时现配），450nm显色TMBS（1mg/ml无水乙醇）1.0ml

底物缓冲液10ml1%H2O225微升

免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第7页2.HRP标识CEA单抗2

戊二醛二步法和过碘酸钠法Ⅰ.戊二醛二步法A.原理：戊二醛为一个双功效试剂，经过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上氨基共

价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第8页B.标识步骤：

(1)称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

(2)反应后酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，搜集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，迟缓搅拌。

(3)将待标识抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4)用1MPH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。

(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。(7)

3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最终沉淀物溶于少许0.15MPH7.4PBS中。

(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保留。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第9页C.需要配制试剂：

(1)

0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。

(2)

1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8PBS1ml混合。

(3)

1MPH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。

(4)

0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01MPH9.5碳酸缓冲液1ml中。

(5)

0.15MPH7.4PBS及生理盐水。

(6)

PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。

(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW)。(8)纯化特异性抗体或抗Ig抗体（购置）。

(9)

HRP(RZ>3.0)（购置）。

免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第10页D.优缺点本法标识步骤比较简单，重复性好。缺点是酶利用率低，普通只有2～4％酶与蛋白质结合。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第11页Ⅱ.过碘酸钠法A.原理：HRP经NaIO４氧化后形成醛化酶可与抗体分子氨基相连，形成斯夫氏碱，后者可深入用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定酶标识抗体。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第12页B.标识步骤:

(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。

(2)于上液中加入0.2ml新配0.1MNaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。

(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mMPH4.4醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。

(4)加20μl0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRPPH升高到9.0～9.5，然后马上加入10mgIgG(抗体，或SPA5mg)在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。

(5)加0.1ml新配4mg／mlNaBH４液，混匀，再置4℃2小时。

(6)将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4℃过夜。

(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。(7)

3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最终沉淀物溶于少许0.15MPH7.4PBS中。

(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保留。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第13页C.需要配制试剂(1)

0.1MNaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂)溶于蒸馏水10ml中。

(2)

1mMPH4.4醋酸钠缓冲液:

0.2MNaAc(1.361克／50ml)3.7ml

0.2MHAc(0.601ml／50ml)6.3ml加蒸馏水至2,000ml。

(3)

0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液:

Na２CO３0.32克

NaHCO３0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01MPH9.5碳酸盐缓冲液。

(4)

NaBH４溶液(4mg／ml):临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。

(5)其它试剂及器材可参见戊二醛标识法。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第14页D.优缺点本法所获酶标识抗体产率高，快要70％HRP和Ig结合，99％Ig与酶结合，酶与Ig活性无重大损失，是当前最惯用方法。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第15页3.Sephadex

G-25层析A.分离原理

：当混合样液加到凝胶柱上，伴随洗脱剂而经过凝胶柱时，分子大小不一样物质受到不一样阻滞作用。颗粒靠近或大于网眼分子，不能进入凝胶网眼中，在重力作用下它们伴随溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻最小分子量称为该规格凝胶排阻极限）；而颗粒小于网眼分子可渗透凝胶网眼之中，它们被洗脱时不停地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。在层析柱出口处，我们用多个试管分步搜集洗脱液，就可将混合物中各组分彼此分离。

当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质脱盐工作，我们可采取层析介质为葡聚糖凝胶G-25，用适当洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就能够将大分子蛋白质与小分子盐类分离。

免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第16页B.试剂配制

1.

葡聚糖凝胶Ｇ-25

溶胀凝胶方法：按每个层析柱约4g量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂浮细碎凝胶，重复3～4次。操作中防止猛烈搅拌，预防破坏其交联结构。

2.

BaCl2溶液（1%）

3.

考马斯亮蓝G-250

称取0.1g考马斯亮蓝G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再加入85%磷酸100mL，最终用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。

4.

脲（6mol/L）

5.

洗脱剂

常规PBS免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第17页C.操作步骤

1.

层析柱准备

(1)

清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗洁净。

（若玻璃柱较脏，应卸去塑料装置，先入洗液中浸泡2小时。）

(2)

安装与检验：检验出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好洁净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂，打开出口螺旋夹，检验有没有渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。

(3)

排气泡：保持柱内一定水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处小气泡易停留在螺旋夹附近乳胶管内，要想法排尽，不然会影响分离结果，排气完成，保留柱内1～2cm高水位，关紧螺旋夹。

(4)

标识高度：在距顶端8～10cm处做一标识，作为衡量灌装层析介质床体高度（15～17cm）依据。2.

装柱

每组用50mL烧杯取溶胀凝胶悬浆25～30mL，静置片刻，观察凝胶沉淀与水体积之比，约为1:1即可，不然应作调整。

轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不停地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标识上方约2cm为止，凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜，都将影响分离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。

免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第18页3.

平衡

取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水口，经洗脱液流动，首先清洗内壁，另首先使胶床收紧。洗脱平衡完成，胶床上方保留约4cm高水位，关闭出水口。此时，胶床高度≥15cm为宜。

4.

准备搜集

取6只洁净刻度试管（除净试管内残留水），1～6编号，并在试管2mL处作一标识，插入试管架上，为搜集洗脱样品作好准备。

5.

上样与搜集

打开出口排水，当胶床与上方水层弯月面相切时，关闭出口，用滴管将0.2mL混合样液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完成，打开出水口，开始搜集一号管。每管搜集洗脱液2mL。

当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入3～5cm高洗脱剂。

免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第19页6.

洗脱

不停向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位3～5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至搜集到6号管达2mL时，关闭出口。

7.

判定

另取6只洁净试管，按搜集次序将洗脱液一分为二，即每管1mL，依次在试管架上排成二排。

第一排每管加2滴BaCl2，依据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中浓度。

第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂，依据蓝色情况，判断蛋白质在各管中浓度。将结果统计于下表中。

若判定第6号管中，仍有样品，表明洗脱和搜集不够，需增加7号、8号……试管继续洗脱与搜集，同上法判定其蛋白质和盐浓度情况。

管

号

项

目

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

白色沉淀量

蓝色深浅

8.

再生

判定完成，打开出水口，继续用２～３倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。

免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第20页四、试验所需购置材料、试剂材料、试剂订购企业价格预计使用量赖氨酸金泰企业（长春）124元/100g100gHRP（辣根过氧化物酶）金泰企业（长春）250元/100mg20mgCEA抗原（L1C00207）上海领潮科技有限企业待询（1mg/mL）1mgCEAIgG1（单抗货号L1C00205）上海领潮科技有限企业待询1mgCEAIgG1（多抗货号L1C00202）上海领潮科技有限企业待询5mgNaIO４金泰企业（长春）80元/100g500mgNaBH４金泰企业（长春）90元/100g500mgSephadexG-25层析柱(2cm×50cm/1cm×25cm)杭州三特医药化工有限企业450元-650元/个1个SephadexG-25郑州勤实科技有限企业300元/25g5g免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第21页13.7.21日过碘酸钠法标识HRP于鼠单抗标识结束，结果以下：利用BioTec多功效微孔板检测仪检测标识物OD280nm及OD403nmOD280nm=0.674OD403nm=0.438IgG量（mg/ml）=（OD280nm-OD403nm*0.3）*0.62=0.336412酶量（mg/ml）=OD403nm*0.4=0.1752克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量=2.08315即2.08315个HRP分子结合在一个抗体分子上。酶结合率=酶量*体积/抗体=52.08%标识率＞0.6免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第22页经过屡次ELISA验证HRP标识成功单抗可用性0.2780.2321.7691.9381.4681.4891.0041.1110.4010.3361：500稀释包被抗原0.2680.2211.6691.8381.3681.3320.9860.9420.3010.3361：稀释包被抗原0.2790.2431.65517711.2641.4750.7650.8050.2890.2951：4000稀释包被抗原阴性对照原浓度单抗1:50稀释单抗1:100稀释单抗1:200稀释单抗HRP标识单抗效价测定（间接法）：抗原（包被）+HRP标识鼠单抗+TMB及终止液显色由以上数据可看出，HRP标识单抗效价为最高1:100，但因为ELISA阳性值在1以上（同时不能过大）为最正确选择，故后续试验应选择1:50稀释酶标单抗，这个效价为HRP标识前单抗效价50%，即本方法标识单抗造成单抗效价降低50%。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第23页使用HRP酶标单抗构建测定抗原（羊肚菌菌丝）含量标准曲线抗原捕捉量测定（双抗夹心法）：兔多抗包被+梯度浓度抗原+HPR标识鼠单抗+TMB及终止液显色抗原浓度（ng/ml)025.0450.0875.12100.16125.20150.24175.28200.32平行对照(OD450nm)0.2160.4320.6890.8761.0021.1891.3511.5061.5240.2310.4250.7010.8431.0241.2041.3871.5231.517平均值0.2240.4290.6950.8601.0131.1971.3691.5151.521免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第24页免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第25页免疫磁珠在ELISA中应用及方案设计

汇报人闫斯楠日期.9.1免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第26页目录1.免疫磁珠技术介绍2.免疫磁珠技术应用及优缺点3.免疫磁珠与ELISA联用方案设计免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第27页1.免疫磁珠技术介绍1.1免疫磁珠结构

免疫磁珠（IMB），也称免疫磁性微球，是一个均匀、含有超顺磁性及保护性壳球形小粒子，基本上有载体微球和免疫配基结合而成。其关键为顺磁性粒子，关键外层包裹一层高分子料，最外层是免疫配基。免疫磁性微球结构免疫磁珠免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第28页载体微球载体微球磁性物质高分子层功效基金属小颗粒（Fe2O3、Fe3O4）如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸、酶类、多糖（淀粉、纤维素、葡聚糖、果胶等）、球蛋白和牛血清白蛋白等如氨基、羧基、羟基，使其表现含有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不一样物理性质免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第29页免疫配基免疫配基经过生物高分子功效基团结合到磁性载体微球上形成免疫磁珠。因为载体微球制备材料和方法不一样，其表现出物理性质也不一样，从而可结合不一样免疫配基，如抗原、抗体、凝集素、DNA和RNA等。配基必须含有生物专一性特点，而且载体微球与配基结合要不影响或改变配基原有生物学特征，确保磁珠特殊识别功效。免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第30页1.2免疫磁珠性质因为免疫磁珠大小和形状含有均一性，从而可使靶物质快速和有效地结合到磁珠上，也可使生成新复合物在磁场中含有相同磁响应性，且行为一致磁珠球形结构可消除与不规则形状粒子相关特异性结合顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移动，从磁场移出时磁性消除，磁珠分散，由此可方便地进行分离和磁性导向保护性壳可预防磁性内核漏出或被载液腐蚀免疫配基可特异性地结合反应体系中对应抗原、抗体、核酸等生物活性物质免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计第31页1.3免疫磁珠技术免疫磁珠（IMB）技术：是一个以特异抗原抗体反应为基础免疫学检测和分离技术。它是以抗体包被磁珠为载体，经过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原-抗体复合物，此复合物在外加磁场作用下发生定向移动，从而到达分离抗原目标。基本原