国家自然基金标书终稿

报告正文立项依据与研究内容（4000-8000字）：项目的立项依据随着机械通气、表面活性物质替代疗法等新技术应用，危重新生儿、尤其是早产儿存活率已显著提高。然而，长时间吸入高浓度氧，幸存者易发生肺部氧化应激损伤。目前，高氧肺损伤已成为发达国家NICU最为棘手的问题之一和婴儿慢性肺疾病的最常见形式。但高氧肺损伤的确切机制尚未完全阐明，更无有效的防治手段。因此深入研究其发病机制，积极防治高氧肺损伤，具有优生优育、提高人口素质的战略意义。高氧肺损伤是一个涉及许多细胞活动的复杂过程，可分为早期的组织损伤两个过程。,ECM）的重建参与了高氧肺损伤的整个病理过程，若ECM重建正常，则损伤完全修复，肺结构正常；若ECM重建紊乱，将导致肺纤维化。因此，ECM重建是关系高氧肺损伤结局的关键因素。本实验室在国内外率先开展了对早产大鼠高氧肺损伤中表达的研究，已发现肺损伤时MMPs过度表达、MMPs/TIMPs失衡是ECM重建紊乱发生纤维化的关键原因[1]（具体研究成果见研究基础栏）。有关MMPs在高氧肺损伤中的作用已为少数国外学者所重视，但高氧肺损伤后ECM重建过程中，引起MMPs过度增加的具体机制是什么？本实验室拟从MMPs的诱导剂和抑制剂两方面深入研究。）在上调MMPs表达中起关键作用。Emmprin是分子量为58KD的质膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，不仅表达于正常组织，还表达于肿瘤组织如肺部肿瘤细胞，提示Emmprin参与体内生理及病理过程[2]。目前，少数文献已证明，体外Emmprin与人成纤维细胞共培养后，成纤维细胞MMPs表达增加。进一步研究表明，Emmprin在细胞表面与自身受体或MMP结合，激活胞内MAPKp38信号通路，该途径激活促进ECM降解[3，4]。但关于Emmprin/MAPKp38对MMPs调节的研究仅限于肿瘤细胞，有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，Emmprin如何调控MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。转化生长因子β（Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β）在下调MMPs表达中起关键作用。研究证明TGF-β刺激可使肺成纤维细胞MMPs生成减少[5]。另有研究发现，TGF-β抑制元件位于MMP-1基因启动子区，严密调控MMP-1在不同生理和病理情况下的表达[6]。进一步的研究表明，TGF-β对MMP-1的作用通过SMAD信号途径介导，该途径激活可阻止ECM降解[5]。因此，推测TGF-β/SMAD对MMPs/TIMPs平衡的调节可能是影响肺损伤后ECM重建的关键因素之一。有关高氧肺损伤后肺ECM重建过程中，TGF-β如何调控MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。近年来对信号转导系统的研究发现，位于大多数细胞质膜上约50-100nm大小的囊性凹陷结构—小窝（caveolae），是许多信号分子完成跨膜信号转导的“驿站”。小窝蛋白（caveolin）是小窝胞浆面包被的一种21-24kD的膜蛋白，是许多信号分子活性状态的重要调节者。在无胞外信号刺激下，caveolin通常与富集于小窝质膜上的各种信号分子、受体及非受体型酪氨酸激酶等相结合，抑制这些信号物质的活性；在激动剂与受体结合后，caveolin分子构象发生变构或共价修饰，调节信号物质的活化状态，参与信号转导调控[7]。有关caveolin在肺ECM重建中的作用，有学者提出肺泡Ι型上皮细胞caveolin表达缺失可能是发生肺纤维化的亚细胞指标。对caveolin-1基因敲除小鼠的研究，肺组织显示肺泡隔因细胞增殖而增厚和肺纤维化。caveolin-1α在肺发育的不同阶段，可表达于不同血管和上皮细胞，呈时相分布[8]。研究发现，caveolin–1与TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ）相互作用，抑制TGF-β介导的SMAD-2和下游分子的磷酸化，从而调节信号转导[9]。Emmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信号传导为酪氨酸磷酸化依赖的MAPKp38途径，申请者推测caveolin能与Emmprin相互作用，调控Emmprin介导的MAPKp38和下游分子的磷酸化。简图如下：胞外信caveolin+?caveolin/Emmprin作用Emmprin/MAPKp38号刺激变构活化+caveolin/TβRⅠ作用TGF-β/SMAD信号整合调控肺ECM重建基于上述，申请者提出如下假设：⑴高氧暴露下MMP诱导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPs增加，ECM重建紊乱的主要原因。⑵高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而影响Emmprin/MAPKp38和TGF-β/SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPs增加，ECM重建紊乱。本人所在的研究室属呼吸系统疾病重点实验室。多年来，本人一直致力于新生儿高氧慢性肺损伤的研究，已成功建立了早产大鼠高氧肺损伤的动物模型、掌握了支气管肺泡灌洗术、体外Ⅱ型肺泡上皮细胞和成纤维细胞培养、核酸、蛋白分析等技术，并对抗氧化酶、细胞因子水平、一氧化氮、MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺损伤发病机制中所起的作用进行了较深入的研究，同时应用地塞米松、维甲酸、人类重组促红细胞生成素、EGb761进行了抗氧化损伤的干预研究（见研究基础栏）。这些理论研究和技术方法的积累为本课题的开展奠定了坚实的基础。本研究如能完成，可望为探索高氧肺损伤后肺ECM重建紊乱的机制开拓新思路，并为寻找有效的预防和干预高氧肺损伤提供依据。仓参考文献TaylorPM,WoodfieldRJ,HodgkinMNetal.Breastcancercell-derivedEMMPRINstimulatesfibroblastMMP2releasethroughaphospholipaseA(2)and5-lipoxygenasecatalyzedpathway.Oncogene2002Aug22;21(37):5765-72LiangL,MajorT,BocanT.Characterizationofthepromoterofhumanextracellularmatrixmetalloproteinaseinducer(EMMPRIN).Gene2002Jan9;282(1-2):75-86LimM,MartineT,JablonsD.Tumor-derivedEMMPRIN(extrocellularmatrixmetalloproteinasesinducer)stimulatescollagenasetranscriptionthroughMAPKp38.FEBSLett1998;441(1):88~92YuanW,VargaJ.Transforminggrowthfactor-betarepressionofmatrixmetalloproteinase-1indermalfibroblastsinvolvesSmad3.JBiolChem2001;276(42):38502-10WhiteLA,MitchellTI,BrinckerhoffCE.Transforminggrowthfactorbetainhibitoryelementintherabbitmatrixmetalloproteinase-1(collagenase-1)genefunctionsasarepressorofconstitutivetranscription.BiochimBiophysActa2000Feb29;1490(3):259-68浴Razan炮iB,戚Zhang逃XL,订Bitze基rM,添etal桑.Cav缘eolin语-1re反gulat垮esTG酿F-bet存a/SMA喊Dsig片nalin援gthr秧ough樱anin倍terac垮tion滴with贞theT只GF-be计taty园pe=1\*ROMAN亲I紧rece井ptor.夕JBi腾olCh俊em20俗01;27啦6丽(9):底6727都~碎6738判Ramir秤ezMI肤,Pol既lack宅L,Mi焰llien携G,e奔tal.任The轰alpha柱-Isof以ormo厨fCav半eolin眠-1Is洗aMa令rker奴ofVa器sculo轿genes仇isin炎Earl猴yLun呼gDev额elopm堂ent.连JHis茄toche眼mCyt刚ochem价2002钱;50(1降):33~厘42批Drab器M,Ve该rkade急P,E油lger虹M,et咏al.燥Loss筛ofca因veola图e,va能scula眉rdys鲜funct向ion,泼andp嫩ulmon甜aryd吸efect浆sin拼caveo偿lin-1掀gene览-disr攻upted廉mice砌.Sci杯ence倍2001;茶293(5奇539):那2449~赞52家项目的研究脏内容、研究育目标,以及击拟解决的关动键问题。研究目标：坡建立早产大叙鼠慢性高氧累肺损伤模型勿，探讨Em堂mprin贴与TGF-霜β蹄调节失衡是胶否为高氧肺症损伤MMP孙s增加，E阔CM重建紊迟乱的主要原毫因；探讨小捷窝蛋白对投死足丝晚累梨颂两条信号通揉路整合的影唇响，为高氧起肺损伤发生戒机制和寻找夸有效防治措阶施提供理论哄依据。研究内容：宁Emmpr卖in/MA暑PKp3颜8信号通路漫活化状态及冶高氧肺损伤由所致ECM渗重建紊乱的振相关性：闲①余研究高氧怀肺损伤不同揪时间点肺组涝织中Emm言prin、污P38、磷版酸化P38斯的表达。屿②扭研究高氧裕肺损伤Em天mprin驼/MAPK捎p38信斑号通路活化肿状态与MM洒Ps表达双谎变量关系。德TGF-冈β嘱/SMAD划信号通路活胀化状态及高托氧肺损伤所打致ECM重室建紊乱的相碌关性得：瞒①塔研究高氧帮肺损伤不同阵时间点肺组抄织中TGF拥-具β茧、T腊β方R导Ι鱼、SMAD鼠、磷酸化S财MAD的表防达。李②医研究高氧候肺损伤T瓶β添R乐Ι但的激酶活性烧，计算磷酸冰化SMAD铺与非磷酸化寨SMAD比嘴值。栽③耀研究高氧畜肺损伤TG泉F-只β张/SMAD告信号通路的筐活化状态与狱MMPs/愈TIMPs末的双变量关鸡系。眯caveo肺lin-1棒对Emmp林rin/M挤APKp因38和TG出F-揉β细/SMAD叛两条信号通辣路及其与高溪氧肺损伤所钢致ECM重盐建紊乱的相牺关性度：朋研究高氧肺将损伤不同时奥间点肺组织嘱中cave揭olin-呈1表达及酪狭氨酸磷酸化兰水平。取研究高氧肺茫损伤肺组织排质膜小窝内存caveo谱lin-1炒与Emmp稍rin的共耐定位。铺研究高氧肺令损伤肺组织崖质膜小窝内遍caveo铁lin-1职与T气β悔R两Ι骡的共定位。异拟解决的关柿键问题：洁成年动物急谁性高氧肺损科伤模型，因已其肺发育已轰成熟，不能执如实反映不处成熟肺的损侵伤情况，并焦且与临床上悄早产儿需长他期用氧情况词差异较大。档本项目采用洪早产大鼠慢代性高氧肺损无伤模型，能并更如实模拟用支气管肺发戚育不良的发特生情况。虽芽然此模型技单术难度较大翼，但本研究燃组在早产大虑鼠模型制备雷方面已积累巨了丰富经验庄，能成功完挺成此模型的模复制。拥本研究假设钞caveo晋lin与E音mmpri叠n的相互作且用可调控E赛mmpri外n/MAP津Kp38制信号通路活胆化；cav狡eolin次-1与T寇β格R很Ι凳的相互作用稻可调控TG航F-敏β僚/SMAD歪信号通路活雪化。以往由洲于技术条件石限制，未能使从形态学上饿直接证实。开借助共聚焦削显微镜观察押和荧光双重呼标记技术可朱解决这一技娘术难题。柄拟采取的研陡究方案及可睛行性分析。研究方法：姻本申课题采用共例聚焦显微镜棋（conf翻ocal拳micro伪scope齿）、免疫荧模光双重标记静和免疫组织狡化学等研究炊方法，辅以华蛋白质与核盼酸分析技术棉（West腰ernB阵lot、N忽orthe续rnBl勉ot方法）优，检测各指枯标的动态变干化，并对各铜指标进行定斯位、定性、述定量分析。合倦众后计：轨扯瞎孩砍丰参照申请者社著作，株实用儿科临紫床杂志，乔⑴麦.检测ca卧veoli器n-1酪氨液酸磷酸化水亏平：挨应用抗ca古veoli丝n-1pA渔b进行免贿疫沉淀翻应用抗磷酸奋化酪氨酸m稍Ab进行胀Weste疤rnBl沾ot分析偿⑵撤.舞检测肺组似织中Emm挠prin、飞P38、磷源酸化P38仰、TGF若-候β垃、TGF-偿βΙ求型受体（T宣β际R倒Ι滑）及SMA丑D-2、磷庆酸化SMA链D表达，探蝶讨高氧肺损梢伤所致EC溜M重建紊乱磁的分子机制或：敬蛋白质染水平检测凑—席Weste签rnBl驻ot。仅mRNA拦水平检测京—诸North荒ernB争lot（或言RT-PC固R）。帐肯⑶矮.级检测肺组阿织中T浑β例R忘Ι喊的激酶活性赛：养T默β震R蹲Ι名分离提取孩—招免疫沉淀法嘉（immu声nopre宅cipit逼ion）姻态T慧β采R派Ι屋与纯化的激蚀酶底物GS畜T-SMA肥D2（由美敞国国立癌症伏研究机构d抗eCae嘱stech动er,M与教授提供）却反应，应用家免疫印迹法余检测磷酸化队SMAD2皂水平，计算凳T割β即R拌Ι室的激酶活性愿。慢⑷呼.救检测肺组织石质膜小窝内踢caveo秃lin/丰Emmpr庭in及ca到veoli挠n-1/T谈β况R躬Ι鞋的共定位及按表达：珍①青样本制备：便制备组灿织切片霉→金加入抗ca伍veoli肤nmAb蹄→歪PE标记的纳二抗贿→命加入抗Em饲mprin讨/T飘β宁R米Ι绘的pAb套→央FITC标腔记二抗彩②损共聚焦显微判镜（TCS萝SP型，德偷国Leic观a公司）检德测共定位；漫应用图象分晃析软件对c流aveol棉in表达强臂度进行半定繁量。革⑸伤．乳应用统计学暂方法处理数巷据：玉应用SAS煎统计分析软劳件，对数据裙进行统计学复分析。技术路线：泽刑逝犯浆冠早产大鼠高傻氧肺损伤模压型待炸caveo联lae蚊印caveo朋lin酪氨舱酸磷酸化状榆态讲（免疫沉淀贞、免疫印迹义）蔑窄仔Emmpr弄in/MA尝PKp3干8湾敞嚼牧竭串TGF-催β艺/SMAD碎陆信号通路研户究趁浩信号通路研僚究骂Emmpr撕in、P3狸8、磷酸化钻P38宇果TGF-杰β聪、T该β床R、SMA鸭D、磷酸化爱SMAD热表达（免疫幸印迹与No壶rther猎nBlo袭t初表达（W三ester写nBlo吃t和Nor求thern气Blot辆）迎或RT-P唯CR)挥骑T巩β陪R寸Ⅰ产激酶活性（朱免疫沉淀和想免疫印迹）caveolin/Emprin共定位(荧光双标记、共聚焦显微镜)caveolin/TβRⅠ共定位(荧光双标记、共聚焦显微镜)劝caveolin/Emprin共定位(荧光双标记、共聚焦显微镜)caveolin/TβRⅠ共定位(荧光双标记、共聚焦显微镜)顺申请者所在雹的研究室属炭于呼吸系统蚀疾病重点实齿验室临床二乓室，本室在量慢性阻塞性勇肺疾病和肺辆纤维化发病条机制的研究欠领域已有大列量工作积累唤，为本项目绪的研究打下趁了良好的工祝作基础。申葱请者及所在蒜研究室在产杀儿高氧损伤喜领域进行了疫一系列开拓愈性研究，已伤熟练掌握急周、慢性高氧齐肺损伤模型莫复制，蛋白撇、核酸分析滴等技术。（罢详见研究基座础栏）韵本项目研究曲的主要成员广之一，香港受合作者教授矿，是国际上探新生儿肺损向伤研究的前兴沿科学家，费目前与本研扛究小组密切贫合作，进行劝有关慢性肺泉损伤研究。狮霍泰辉教授旬除承担实验星指导，并提限供部分试剂插。逝新一代共聚贫焦显微镜具稼有观察亚细沉胞结构的立案体定位功能剩，用其检测照在体组织c叠aveol俱in/Em纪mprin吐、cave泼olin/址T之β必R献Ⅰ核信号分子在咬亚细胞位点佩的共定位表野达，虽无文介献报道，在含技术上难度授较大，但申萍请者已掌握矿了多种荧光惜标记技术，备应用共聚焦宋显微镜观察福caveo读lin-1芳在细胞质膜宿上的定位表光达也已获成公功。申请人端所在单位的硬医学中心的饶共聚焦显微成镜和本实验让室的基本研探究设备，能蹲保证本实验热研究完成。狸本项目的特遭色与创新之故处。简理论上的创腹新：沈研究Emm洒prin/航MAPK威p38信号抽通路在器官仁发育和组织殊病理损伤中补的作用,国盟内外尚无文闲献报道。馅本课题研究为caveo另lin对E恶mmpri宗n/MAP嚼Kp38从、TGF-元β铃/SMAD馆共调节机制渣，将为早产弊儿高氧肺损理伤发病机制酒开辟新的研眉究领域，并徒为其防治开纸拓新思路。菠方法上的创层新：无以在体组织污为研究对象俯，应用免疫浴荧光双重标悬记共聚焦显纳微镜技术研商究cave长olin/促Emmpr样in、ca货veoli警n/T淹β鲁R侍Ι候共定位，国偿内外未见文杨献报道，可耽望为深入研盛究小窝蛋白破对信号转导渠的调控机制厦开辟新途径夏。弟年度研究计富划及预期研碌究结果。胜年度研究计银划及预测进柏展豪本课题份研究内容预逗计用3年时藏间完成.盏20信04年1月赛~8月疗①椒购买所需试咐剂。找②戏建立预实验指动物模型。石③魂进行各项预比实验。由20羡04年9月倦~2005凤年2月慰①升建立动物模顾型。肃②抹完成标本的凶收集。斜20停05年3月晕~7月油荒作两完成MM签Ps、TI山MPs、T裹GF-另β奏、T予β真R两Ι肢、SMAD奶2及其mR上NA表达的联研究，并进灾行阶段性总幕结。朗20确05年8月逗~2005来年12月馋冤朝鞭完成鸡caveo疏lin-1源表达和ca劈veoli解n-1/T匪β全R调Ι威共定位研究胳，并进行阶脆段性总结。诱20餐06年1月主~2006异年6月茎州完成c组aveol气in-1的则酪氨酸磷酸淋化状态研究汗，并进行阶臂段性总结。救骂20斯06年7月绝~12月根佩研究数据资吊料分析、总脆结、论文撰可写及成果鉴匠定。敏预期研究涛成果努本项目所建秀立的早产新夏生大鼠慢性标高氧肺损伤痰模型，不仅聋为本课题提叼供了研究对江象，而且为面研究高氧肺合损伤后肺E之CM重建提世供了模型。条本研究可望呆为阐明早产殖儿高氧肺损蜻伤机制提供利新的线索：苦⑴清高氧暴露下猪MMP诱导浓剂/抑制剂枕失衡是高氧正肺损伤MM盈Ps增加，偏ECM重建释紊乱的主要堆原因。虾⑵秃高氧暴露使荐质膜小窝表惩达或功能异音常，从而影刚响Emmp需rin/M危APKp贩38和TG扩F-泊β妨/SMAD李两条信号通燃路整合，继医而导致MM隶Ps增加，虾ECM重建筹紊乱。本研虹究内容也可景能为预防和腥干预高氧肺菜损伤提供理摸论依据。塑（二）研究你基础与工作回条件工作基础户1.与本禁项目有关的朝研究工作积生累和已取得品的研究工作苍成绩吐本课题组多峡年来一直进瘦行高氧肺损变伤的发病机君制及防治的见研究，做了换许多基础和拌临床研究工盲作。已成功痰建立早产新陵生大鼠高浓孤度氧（85耗%～95%税）急性肺损垄伤和慢性肺科纤维化的模扇型；已完成稻肺组织中各粱种抗氧化酶兔活力、羟脯欺氨酸含量与坊肺纤维化的蜡相关性研究但；内源性一干氧化氮在高料氧肺损伤中魄双重作用的捡研究；体外妈高氧对肺泡网巨噬细胞分默泌IL-8怎的影响研究吼；TGF-聋β由在早产大鼠泼高氧肺损伤拨肺组织中表屠达的研究；器基质金属蛋形白酶及其抑批制剂在高氧致肺损伤中的塘作用机制的帮研究；及促古红细胞生成陈素、地塞米醒松、维甲酸迷对新生鼠高您氧肺损伤的书干预研究。获奖课题怀目前正承担渡的相关科研葵项目：1.2.蒙相关研究工誉作发表的文简章：怨附：鹅基质金属蛋陆白酶及其抑招制剂在高氧党肺损伤中的吐作用霸1.照高氧组病理窑学改变电集馋夸肠打湿2.白尸高氧组附MMPs禽表达御衰转腾绿图所1想肺发育不良托，示肺泡医批戏饿图续2平细胞增生、秧间质纤维姻蹲北图型3MMP拉-2钱强阳性表达诞数目减少、包结构简单忌闷凑寄须化改变轧3.峡酶谱法测梳BALF雕中明胶酶活晚性吓4藏.回高氧暴露后赔MMPs是、个TIMPs拳表达增加暖煌尺榆妇MMP-2苦M慢MP-9菌TIM妥P-1然TIMP垒-2袄3dO轮2观0.46刃±报0.36阻0.90示±延0.64足2.00和±糟0.47辆0.30题±晨0.23薄码什air炭0.0理7约±妙0.10欣0.07陕±体0.16逃0.87认±烤0.5