第13章 细 胞 凋 亡 技 术

第13章细胞凋亡技术细胞凋亡〔Apoptosis〕又称程序性细胞死亡〔Programmedcelldeath简称PCD〕，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，在机体中承当着重要的调控作用。它不仅在维持细胞群体数量的稳定、胚胎发育和免疫系统的克隆选择方面，而且在肿瘤发生、开展、抗肿瘤药物的治疗等方面均具有十分重要的作用。细胞凋亡是由基因编程控制的细胞主动参与的自杀过程，是一种生理性调节机制，与细胞坏死的死亡机制是完全不同的，与细胞凋亡相关的癌和抑癌基因有两类，一类是促进凋亡的如C-myc、野生型P53、Fas和Fasl、bcl-xs、bax、ICE、bak、bad等；另一类是抗细胞凋亡的基因，如突变型P53、bcl家庭的bcl-2、bcl-XL及病毒来源的BHRF1等，这两类基因与调控细胞凋亡密切相关，在肿瘤研究中，如果促凋亡基因活化和高表达，将会导致肿瘤的发生和恶化，用药后受抑，说明药物疗效好，预后佳，肿瘤发生与开展受抑制。反之，假设促凋亡基因受抑，肿瘤发生和开展恶化。如果抗凋亡的基因活化和高表达将促进肿瘤的发生与开展，会导致肿瘤细胞耐药、预后不良；反之肿瘤的发生与开展受抑，对放/化疗敏感，疗效好。由此可见，研究细胞凋亡不仅对研究组织和细胞的分化有理论研究价值，而且对肿瘤的发生和开展及临床治疗均有指导意义。一、细胞凋亡的特征细胞凋亡的特征是内源性核酸内切酶的激活，染色质DNA被有规律地切成整数倍的核小体片断，凝胶电泳呈梯形图像，电镜下可见有形态学变化，如细胞邹缩，胞膜完整，胞浆致密，染色质浓缩成新月形并断裂，有核膜包绕含核碎片的凋亡小体形成。经DAPI即4-6-二脒基二苯基吲哚(4.6-diamido-2-phenylindolehyodrochloride)荧光染色，可见有细胞固缩，核断裂后形成大小不等的块状或颗粒状的荧光碎片。由于核断裂后形成的小片断可透过膜而丧失，仅剩下大片断在流式细胞检测细胞周期时可测出，称“G1〞期的AP峰〔即凋亡峰〕。细胞死亡包括坏死和凋亡两种形式，两者区别如表13-1所示。表13-1细胞坏死与凋亡的区别凋亡(Apoptosis)坏死(Necrosis)〔1〕、定义：一种与遗传机制有关的(即由基因调控的)主动的、自发死亡的方式，无炎症反响。外在的致损伤因素作用到达一定强度，持续一定时间后所导致的细胞死亡〔被动〕，有炎症反响。〔2〕、形态学观察细胞核：核浓缩、碎裂(染色质浓缩→有规律性、断裂成核碎片)，有新月形凋亡小体。细胞器：完整细胞膜：完好细胞体积：细胞浓缩在组织中：常呈单个细胞发生核溶解(无规律的染色质团块→溶解)无规律性。崩解尚失去完整性细胞肿胀常成群细胞发生〔3〕、生物化学检测核DNA有规律断裂50～300kb/或180bp左右的片断凝胶电泳：呈梯形条带(ladder)DAPI萤光染色，片状、颗粒状核荧光。流式细胞仪检测：可见亚G1峰(AP峰)核基因表达：必须DNA酶活性：必须蛋白激酶活性：必须细胞器环境：Na+/K+泵功能完好DNA无规律地断裂条带不清〔smears〕无颗粒或片状核荧光出现无此峰——————功能丧失二、细胞凋亡试验常用的方法我们曾用化疗药物及其抗癌中药对肿瘤细胞如HL-60，K562和肝癌细胞系(SMMC-7721)进行了细胞凋亡的研究，我们利用流式细胞仪测AP峰，荧光法测核断裂荧光碎片，凝胶电泳测梯形条带，电镜法观察凋亡小体的存在，为了掌握好用药的剂量和作用时间，又先用MTT法测试药物对肿瘤细胞生长的抑制作用，探索IC50以及药物的剂量依赖性和作用时间的依赖性，其试验方法如下：(一)药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法(1)用RPMI1640全培将肿瘤细胞调整至2×108/L，在96孔板中每孔参加100ul细胞悬液于37℃5%CO2培养过夜。(2)次日每孔参加不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照组，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇为溶剂对照，每组均设4～6个复孔〔平行孔〕、37℃5%CO2继续培养。(3)培养至12h、24h、48h，实验终止前4～6小时参加10ulMTT〔5g/L〕，培养4～6小时后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色甲颗粒结晶时加100μl/孔SDS-HCL终止反响，于37℃存放过夜。(4)用酶标仪在A570波长下测吸光度A值，按下式计算抑制率。抑制率〔%〕=〔1-试验组平均A值/阴性对照组平均A值〕×100%。(二)荧光法(1)选用上述最正确浓度作用于肿瘤细胞，培养48小时后，收获细胞用PBS洗2～3次后用0.4%多聚甲醛(用pH7.4PBS配)室温下固定30分钟。(2)弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton、X-100作用4分钟参加适量的0.5mg/LDAPI荧光染色60分钟，用PBS冲洗3次，取10ul滴片枯燥后于荧光显微镜示检断裂的颗粒和片状荧光(见书后照片)。凋亡细胞的核荧光×400(三)DNA琼脂糖凝胶电泳法1.DNA提取(1)用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3×108/ml每个药物浓度、作用时间均设2瓶，共分三个时间段，四个药物浓度，共培养26瓶细胞〔24瓶试验组，2瓶阴性对照组〕。〔2〕分别于细胞中参加不同浓度的药物，于37℃5%CO2中分别培养12、24、48小时收获细胞，用PBS洗2～3次。〔3〕于-20℃将细胞冷处理10分钟后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液〔10mmol/LTris-HClpH8.0、1mmol/LEDTA、10mmol/LNaCl、1%SDS〕再加蛋白酶K〔终浓度1g/L〕轻轻振摇使悬液混匀，呈粘糊状，50℃过夜。〔4〕冷却后参加等体积的饱和酚溶液，混合后10000g离心10分钟，小心吸出上层水相，移至另一离心管中，再参加等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。〔5〕吸上清参加氯仿：异戊醇〔24:1〕按上述方法再抽提一次。〔6〕吸取水相层参加1/10体积的3mol/L醋酸钠溶液，混匀。〔7〕再参加2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30分钟后，10000g离心10分钟，沉淀局部为提取的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗两次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。〔8〕参加200ulTE缓冲液〔1mmol/LEDTA40mmol/LTrisHClpH7.8〕溶解DNA，再参加25ul的RNA酶〔10g/L〕放置37℃作用30分钟，置4℃冰箱保存。2、琼脂糖凝胶电泳〔1〕用TBE〔1mMEDTA、PH8.0、45mM/LTris-硼酸〕缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖溶解，待冷却至60℃时，参加溴化乙锭〔10mg/ml〕使其终浓度为0.5mg/ml,混匀后灌胶。〔2〕待胶凝固后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE液盖过凝胶。〔3〕取10～15μl提取的各组DNA样品液与上样缓冲液〔含0.25%溴酚兰，4%蔗糖〕按4:1比例混匀后点样。〔4〕60V电泳1小时，用紫外射透射仪观察梯形条带，并摄影〔见书后照片〕。凋亡细胞核酸电泳的梯形条带(四)透射电镜形态学观察法(1)收集药物作用后最正确凋亡时期的凋亡肿瘤细胞，细胞总量大于106细胞，用PBS洗两遍后用3%戊二醛固定1小时，PBS洗两次，再用1%锇酸固定1小时，丙酮酸梯度脱水。(2)细胞用树脂包埋，并进行超薄切片，用醋酸钠-枸椽酸铅染色，透射电镜下观察凋亡的细胞形态，可见有染色质浓集，不均匀分布，靠核周边形成有核膜包裹断裂的核碎片，呈新月体即凋亡小体(Apoptoticbodies)，并选择典型切片图象摄影(见书后照片)。凋亡细胞核内形成的早期凋亡小体〔染色质边聚〕×12000凋亡细胞核内形成的星形凋亡小体×12000凋亡细胞核内形成的晚期凋亡小体×12000(五)流式细胞仪检测法1、原理处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相(G0/G1SG2/M期)其DNA含量分布在2n～4n之间，发生凋亡的细胞内与核内DNA裂解成许多小片断，用细胞膜通透法可使小分子量的DNA片断穿过胞膜而丧失，仅剩下大片断DNA，这些失去局部DNA的细胞可形成一个DNA含量小于2n的分布区，称“亚G1峰〞即AP峰〔即凋亡峰〕。图13-1流式细胞仪检测凋亡细胞的凋亡峰图2、特点〔1〕经济简便，仅需单一染色；〔2〕可判断凋亡细胞发生于哪一周期；〔3〕可定量测定凋亡率，结果客观可信；〔4〕用同样本可同时进行“亚G1峰〞及DNA凝胶电泳。3、方法步骤〔1〕收获不同剂量药物作用于各不同时期的肿瘤细胞，细胞总数应大于106细胞，用PBS洗2次，参加70%酒精固定4℃存放。〔2〕染色前用PBS离心沉淀去除固定液，并用PBS洗1～2次，参加200ulRNaseA,37℃水浴30分钟。〔3〕每毫升细胞悬液中参加碘化丙锭〔PI〕染色液100ul混匀，至4℃避光30分钟，用流式细胞仪进行细胞周期分析，低于G1期DNA含量细胞为凋亡细胞，测定“亚G1峰〞〔即AP峰值〕和细胞凋亡率。除上述常用的方法外，还可采用ELISA法。其凋亡的断裂核可被抗组蛋白抗体及抗-DNA抗体混合物反响后形成双抗体“夹心〞结构，再经酶显色也可判断。〔2〕末端转移的酶标记技术，利用核裂解碎片上含有3'-OH末端，在末端转移酶〔或DNA多聚酶〕作用下参加已标记的核苷酸〔或核苷酸混合物〕，在3'-OH末端上合成一段含标记的尾巴，再经过酶显色或用荧光抗体显示出来。三、BCL-2凋亡基因表达的检测技术(一)原理细胞凋亡是一个受基因调控的主动过程，bcl-2是抑制细胞凋亡的原癌基因，在正常细胞的激活和发育过程中都有表达，但在发育成熟的细胞中，其表达降低，在低分化或癌变的细胞中，bcl-2高表达与肿瘤的发生、开展相关，bcl-2过量表达常导致对化疗药物的耐药性而阻止细胞凋亡，影响治疗效果，一旦细胞发生凋亡，其bcl-2表达降低，甚至完全消失。bcl-2家族由bcl-2、bcl-x、bax、mcL-1和A1组成，现认为bcl-2基因是凋亡抑制基因，其易位和高表达与肿瘤和自身免疫性疾病的发生有关。因此，进行bcl-2基因表达的检测有两种，一种是用抗bcl-2蛋白抗体的流式细胞仪测定法，检测细胞浆中的bcl-2蛋白量；另一种是采用RT-PCR法测细胞中bcl-2mRNA的表达。(二)方法1、bcl-2蛋白表达的检测采用流式细胞仪和间接免疫荧光法测定细胞中bcl-2蛋白量的，具体方法为：(1)收集药物不同剂量、不同作用时间的凋亡肿瘤细胞，用含2%小牛血清的PBS洗2次。(2)参加2%多聚甲醛(用PBS配制)室温固定20分钟，再用PBS配制的Staing缓冲液(2%灭活的人AB血清，0.1%NaN3)洗涤。(3)1500r/min离心5分钟，弃上清置-20℃存放过夜。(4)在冻存的细胞内参加1mlPBS配制的TB穿透夜(0.2%Triton、X-100,0.1%小牛血清)放置5分钟，用Staing缓冲液洗一次后，加2%灭活的人AB血清1ml，37℃放10分钟。(5)参加bcl-2多抗(免抗人)工作液40ul，4℃孵育30分钟，对照组不加多抗。随后用PBS洗3次，5分钟1次。(6)参加FITC荧光标记的二抗(羊抗免)工作液40ml，4℃孵育30分钟后，用PBS洗3次，用流式细胞检测荧光强度(MFI)的变化，计算bcl-2阳性细胞表达率和bcl-2蛋白表达的平均荧光强度。2、RT-PCR法检测细胞bcl-2mRNA的表达(1)总RNA提取。为了获得高质量的真核细胞mRNA，必须使用RNA酶抑制剂。操作过程中应防止RNA酶污染器材和试剂，因此所有玻璃、塑料器材先用0.1%DEPC水溶液浸泡12小时，然后用无菌的新鲜蒸馏水淋洗数次，塑料器材应采用高压蒸气灭菌。玻璃器材应于180℃干烤4～6小时，所有溶液配制用水均用已灭菌的新鲜蒸馏水配制，所用试剂要用新开封的试剂，或无菌分装至已处理的容器中，操作时应戴60Co辐照的一次性手套，并勤换，以防止环境中或操作时的RNA酶污染。提取总RNA，采用异硫氰酸胍一步提取法即可。方法如下：①收集药物处理和对照组的肿瘤细胞，用PBS洗2次，冷藏5分钟。②参加变性液SolutionD1ml(4mol/L异硫氰酸钠，25mmol/L柠檬酸钠，0.1mol/L巯基乙醇，0.5%十二烷基肌氨酸钠)。③用4号针头抽打混匀，再参加0.1ml的3mol/L乙酸钠(pH4.2)充分混匀，加80%水饱和酚(pH5.6)1ml，氯仿:异戊醇(24:1)，0.2ml混匀后置冰上15分钟。④于4℃12000r/min离心5分钟，取上清移入另一洁净的塑料离心管中，加2.5倍体积的无水乙醇〔-20℃预冷〕于-20℃过夜。⑤次日以4℃12000rmin离心30分钟弃上清，用70%预冷乙醇洗两次，枯燥10分钟，加100ulDEPC水溶解RNA，再参加300ul，SolutionD液混合，再加2.5倍乙醇，-20℃放2h。⑥用70%预冷乙醇洗两次，加DEPC水溶解，紫外分光光度计测OD260，OD280值。当OD260/OD280在1.8～２时，RNA纯度较好。为了证明所提RNA是否降解，可采用RNA甲醛变性电泳。(2)RT-PCR①合成cDNA第一链各组取5μg至RNA进行逆转录，反响体系共20ul。5X逆转录缓冲液5ul；DTT1ul；dNTP(200μM)2ul；RNasin1.5ul；OligodT2ul；m-MLV逆转录酶(200U/ul)2ul；RNA样本5μg；DEPC水补充加至20ul〔即6.5ul〕上述组分充分混合后，先在室温作用10分钟，后在42℃反响1h，经95℃10分钟，立即至冰浴冷却至4℃，逆转录产物即cDNA第一链于-20℃冻存备用。②PCR反响扩增Cdna。设计bcl-2的引物序列如下：P1上链：5'-GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG-3'P2下链：5'-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3'外参照β-actin的引物序列如下：P3上链：5'-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3'P4下链：5'-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3'扩增的产物长度分别为459bp，339bp。以逆转录产物为模板分别与bcl-2引物，β-action引物混合，反响体系共有50ul。ddH2O32.5ul；10×buffer5ul；MgCl25ul；dNTP(200μmol/L)1ul；p1/p30.5ul；P2/P40.5ul；TaqDNA多聚酶0.5ul；cDNA样品〔逆转产物〕5ul；扩增条件：94℃预变性7分钟，设计PCR循环程序，94℃变性60秒，55℃复性50秒，72℃延伸60秒，共30个循环周期，然后72℃延伸5分钟，4℃保存备用，并供凝胶电泳〔方法同前〕。每组取PCR扩增产物8ul在TBE缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳(2%)。电压80V，电泳40分钟，紫外透射仪下观察电泳条带，其荧光带亮度可随凋亡的程度而有变化，证明bcl-2基因表达与不同剂量化疗药物作用不同时间，bcl-2基因表达与细胞凋亡呈剂量、时间依赖性(见书后照片)。此法只能从电泳条带荧光亮度进行目测不够准确，最好采用荧光PCR定量仪更加准确可靠。四、细胞凋亡的分子机制细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，机体内外多种因素可影响细胞凋亡的发生，如Ca++、Mg++、糖皮质激素能促进细胞内源性核酸内切酶活性，促进细胞凋亡，而Zn++能显著抑制Ca++和糖皮质激素这种诱导凋亡的作用，钙离子通道剂A23187可诱导细胞凋亡，但又可被内切酶阻断剂玫红三羧酸阻断。此外，类固醇、细胞毒性物质、秋水仙碱均能诱导细胞凋亡。目前发现某些因素或因子可以特异性地诱导某种或某类细胞发生凋亡，某些对生长因子依赖性细胞，当生长因子耗尽或撤除时那么发生凋亡；某些基因表达产物对细胞凋亡具有明显的促进或抑制作用。1、诱导细胞凋亡的因素或因子诱导细胞发生凋亡的因素或因子很多，有些具有普遍性作用，如各种因素(射线辐射、热休克和紫外线照射等)导致的DNA损伤，可诱导多种细胞发生凋亡。有些那么具有一定的组织特异性，如糖皮质激素对淋巴细胞，转化生长因子β1(TGFβ1)对肝细胞的凋亡诱导作用。在胸腺细胞发育的一个时期，T细胞抗原受体的诱导作用可导致胸腺细胞发生凋亡。在某些靶细胞中，肿瘤坏死因子(TNF)可诱导其发生凋亡，这些靶细胞外表具有TNF受体，其TNF受体与Fas同源。许多抗肿瘤药物可诱导肿瘤细胞发生凋亡，如阿霉素和道诺霉素、顺铂、表鬼臼脂表、长春新碱和秋水仙素等。表13-4列举了一些细胞凋亡的诱导因素或因子。表13-4一些细胞凋亡的诱导因子诱导因子细胞类型T细胞抗原受体胸腺细胞Fas/Apo激活胸腺细胞和其他细胞TNF各种细胞细胞毒T细胞溶解受感染细胞糖皮质激素淋巴细胞DNA损伤各种细胞Dioxin胸腺细胞谷氨酸神经元TGFβ1肝细胞细菌感染巨噬细胞2、细胞生长因子去除后的细胞凋亡越来越多的研究说明，最初被作为细胞增殖因子的多肽生长因子中，有一些是细胞的存活因子(viabilityfactor)具有抑制细胞死亡、减少正常细胞丧失的功能，为多种类型细胞〔或许是所有类型的细胞〕的存活所必需。几乎可以说，所有的哺乳类动物细胞都要依赖于一种以上的生长因子来维持其存活，这些依赖的细胞因子存在和去除，对PCD有抑制和诱导作用。然而，在许多情况下，这些细胞生长因子对其靶细胞的细胞凋亡抑制作用并非特异，可被各种生长因子所替代。表13-5列举了一些生长因子去除后发生的细胞凋亡。去除生长因子诱发PCD反响的机制，目前尚未完全弄清楚。不过，一些研究者提出，生长因子去除后，靶细胞受体获得的信号减少，引起信号传导途径的削弱，进而引发细胞许多根本功能的下调。例如，代谢速率减慢后，基因表达模式也会因此而发表13-5细胞凋亡的细胞因子细胞类型因子造血原始干细胞各种细胞因子T淋巴细胞白细胞介素-2B淋巴细胞抗原嗜酸性细胞白细胞介素-5神经元神经生长因子胶质细胞血小板源性生长因子乳腺雌激素，黄体酮前列腺雄激素表达c-myc的纤维母细胞血清生改变。Evan等人的实验说明，生长因子去除后基因的“不平衡〞表达，对这些细胞的PCD生成起关键作用。例如，IL-3依赖的祖细胞，去除IL-3后，细胞c-myc基因表达过度，加速了PCD的生成。已报道的诱导凋亡物质见表13-6。表13-6已报道的诱导凋亡的物质生理性激活剂损伤相关诱导剂治疗相关因素毒素1.TNF家庭1.热休克1.化疗药物1.乙醇FAS配体2.病毒感染顺铂2.β淀粉肽TNF3.细菌毒素阿糖胞苷2.转化生长4.癌基因myc,长春新碱因子βrel,ElA氨甲喋呤3.神经递质5.肿瘤抑制因子阿霉素谷氨酸P53争光霉素多巴胺6.细胞溶解性氨芥NA-甲基-D-天门冬氨酸T细胞2.γ射线4.生长因子7.自由基3.UV射线缺乏8.抗氧化剂5.基质的丧失9.营养素缺乏-附着体抗代谢物6.钙7.糖皮质激素3、细胞凋亡的抑制对细胞凋亡具有抑制作用的因素主要有以下几个方面。某些癌基因或细胞凋亡相关基因具有抑制细胞凋亡的作用，如bcl-2、bcl-Xl(大分子蛋白)和突变型P53等。某些病毒感染靶细胞后，为延长其宿主细胞的寿命，以利其自身的修复，那么抑制宿主细胞发生凋亡。如EB病毒在感染宿主细胞中诱导bcl-2表达，并编码bcl-2基因产物的同类物；腺病毒的E1B19000蛋白具有抑制细胞凋亡的作用。某些细胞生长因子，如造血集落刺激因子(CSF)和神经生长因子〔NGF〕、以及白细胞介素类〔IL〕具有抑制细胞凋亡的作用。正常的造血细胞因子，如粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子〔GM-CSF〕、IL-3和IL-6对细胞毒抗癌药或TGFβ1所介导的细胞凋亡具有抑制作用，IL-6对野生型P53介导的细胞凋亡具有抑制作用，IL-4对用氢化可的松介导的慢性淋巴细胞性白血病细胞凋亡具有抑制作用。研究发现，在某些细胞凋亡发生过程中，存在大分子蛋白质的主动合成，某些药物如放线菌酮和放线菌素D，可通过抑制RNA和蛋白质的合成，可抑制某些因素诱导的细胞凋亡。已报道的抑制凋亡物质见表13-7。表13-7抑制细胞凋亡的物质生理抑制剂病毒基因药理学因素1.生长因子1.腺病毒ElB1.钙蛋白酶抑制剂2.细胞外基质2.杆状病毒P352.半胱氨酸蛋白酶3.CD40配体3.牛痘病毒CrmA抑制剂4.中性氨基酸4.杆状病毒IAP3.肿瘤启动剂5.锌5.EB病毒BHRFI，LMA-1PMA6.雌激素6.非洲猪热病毒LMW5-HL苯巴比妥7.雄激素7.疱疹病毒y34.5α-六氯环乙烷〔二〕细胞凋亡相关基因及其调节许多研究资料说明，细胞凋亡的激发与抑制是受遗传因素影响的.有多种基因参与细胞凋亡的基因调控，其详细的机制目前尚不清楚。表13-8中列举了多种对细胞凋亡具有诱导或抑制作用的基因，其中一局部是癌基因，一局部是应用减数杂交等方法从凋亡细胞中别离的特异性细胞凋亡相关基因。表2-8诱导或抑制凋亡的基因诱导抑制野生型P53bcl-2去调节c-mycPM