自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)使用的指南1404

7.自噬双标腺病毒〔mRFP-GFP-LC3使用指南源还有争议,大部分表现为双层膜,有时多层或单层包裹部分胞质和细内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体,最后与溶酶体融合形成westernblot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光近几年对自噬流的研究日趋增多,针对于此我们汉恒生物科技〔上海了用于实时监测自噬<流>的mRFP-GFP-LC3腺病毒,mRFP用于标记及追踪LC3,GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体,即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感,当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平,是我们自噬研究mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作2/7.冰箱保完。在-20℃下长期保存。如果病毒储存时间超过6实验需求自行分装或购买经过分装的养目的细胞S物实验建议使用注射用平衡液来稀释,并尽激处理的时间来选择感染腺病毒的时间,短时程处理〔一周之内建议先感染腺病毒之后再进行处理,长时程刺激的建议在刺激结束前I染正式感染目的细胞前,需要做一个预实验以确定目的细胞中加入的3/7.,接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同,一般是保证第二天件允许最好使用共聚焦显微镜拍照,此时需要把细部分细胞铁壁能力不是很强,此时需要预先在玻见下表格。加入的病毒量范围在MOI=20~50内〔具体感染的操作量0.3cm224-well12-well6-well60mm100mm100ul500ul1ml2ml4ml10ml50ul250ul500ul1ml2ml5ml2cm24cm210cm220cm260cm296-well/cm2是悬浮或半悬浮细胞,/7.,进行低速离心,去掉大部分上清,然后加入适量的病感染24小时后,可以开始观察到GFP以及RFP表达,36-48小时可5/7.即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱:一般统计采用人为计数的方法,也AntioxidRedoxSignal14<11>:2179-2190.-092-0065；xduringischemia/reperfusion."AntioxidRedoxSignal14<11>:2179-2190.Ma,X.,etal.<2012>."Impairedautophagosomeclearancecontributesto3170-3181..anddisease."NEnglJMed368<7>:651-662.M.Lee,T.Strowig,F.Arrey,G.Conenello,M.Pypaert,J.Andersen,A.blocksautophagosomefusionwithlysosomes."CellHostMicrobe6<4>:367-380.<2010>."DeacetylationofFoxObySirt1PlaysanEssentialRoleinMediatingStarvation-InducedAutophagyinCardiacMyocytes."CircRes107<12>:1470-1482.Levine,B.andG.Kroemer<2008>."Autophagyinthepathogenesisofdisease."Cell132<1>:27-42.Mizushima,N.,T.YoshimoriandB.Levine<2010>."Methodsinmammalianautophagyresearch."Cell140<3>:313-326."Plasmamembranecontributestotheformationofpre-autophagosomalstructures."NatCellBiol12<8>:747-757.Ravikumar,B.,S.Sarkar,J.E.Davies,M.Futter,M.Garcia-Arencibia,S.Luo,D.C.Massey,F.M.Menzies,K.Moreau,U.Narayanan,M.Renna,"Regulationofmammalianautophagyinphysiologyandpathophysiology."PhysiolRev90<4>:1383-1435.Wei,Y.,Z.Zou,N.Becker,M.Anderson,R.Sumpter,G.Xiao,L.Kinch,Minna,G.BhagatandB.Levine<2013>."EGFR-MediatedBeclin1PhosphorylationinAutophagySuppression,TumorProgression,andTumorChemoresistance."Cell154<6>:1269-1284.加入病毒数量/ul0.5；2；6.5；7.5；25；15；50大约数目2-5×1041-2×1052-3×1055×1051-2×1061-5×1060.5-2×1071-3×1072.5-5×1070.5-2×10850-10050-10050-10050-10050-10096well48well24well12well6well0.5-2ul1-3ul2.5-5ul5-20ulMOI值腺病毒规格/7.3535mmdish1-2×10650-1000.5-2×1085-20ul5；15；5060mmdish2-4×10650-1001-4×10810-40ul10；30；100100mmdish6-10×10650-1003-10×10830-80ul30；100；300150mmdish1-2×10750-1000.5-2×10950-200ul60；180；600腺病毒滴度以1010/ml为准,其他滴度需相应换算；大约细胞数目是根据80%~100%细胞密度估算而出,具体细胞数请种细胞时进行细胞计数。