重组小鼠CK2α′亚基的GST融合表达、纯化及活性测定

重组小鼠CK2α′亚基的GST融合表达、纯化及活性测定重组小鼠CK2α′亚基的GST融合表达、纯化及活性测定

：黄雪坤，梁景耀，刘新光，梁念慈

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重组小鼠CK2α′亚基的GST融合表达、纯化及活性测定

磷酸化酪蛋白2g/L.反应温度为30℃.加15μL层析收集的酶液启动酶反应,反应10min后取30μL点至直径2cm的P81磷酸纤维素滤纸上终止反应,阴干,用85mmol/L磷酸洗涤数次,最终用丙酮洗涤1次,80℃烤干后,加闪耀液于液闪仪计数.每收集管做2个平行管测活(但酶性质试验则做3个平行管).每分钟催化1pmol［γ32P］ATP或GTP上的32P转移到酪蛋白上所需的酶量为1个酶单位.

1.2.3蛋白定量和SDSPAGE蛋白质密度扫描蛋白定量按文献［4］的方法,以牛血清白蛋白作为标准进行定量.表达的CK2α′亚基蛋白占菌体总蛋白的比例则用扫描仪扫描SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳图上相应的泳道，再使用QuantiScanDemo软件对这泳道上的各种蛋白带进行半定量扫描，得出各种蛋白带的吸光度值（波浪线下的面积代表对应蛋白的质量）

，将目的蛋白的吸光度值除以各种蛋白带的总吸光度值，从而算出目的蛋白占菌体总蛋白的比例.

2结果

2.1小鼠蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的表达重组质粒pGEXGSTMCK2α′转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后可大量表达出一Mr约为64×103的新蛋白分子(图1,泳道2),与GST(Mr约为26×103)和小鼠CK2α′亚基(Mr约为38×103)的理论Mr总值相符.而未用IPTG诱导的表达菌中CK2α的过度表达则不明显(图1,泳道1)，说明重组质粒在大肠杆菌中得到了特异高效表达.图1,泳道2扫描结果表明，表达的融合型CK2α′蛋白占细菌总蛋白的31.1%左右(图2).

2.2纯化表达产物的分子量经谷胱甘肽琼脂糖珠4B1步层析柱的分别纯化,SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳的银染结果表明,最终的纯化产物显示出Mr为38×103的单一条蛋白带(图3,泳道1),说明分别纯化是胜利的.

2.3纯化的表达产物的性质

2.3.1蛋白激酶CK2全酶的构成为了观看原核表达纯化的小鼠CK2α′基能否与原核表达并经柱层析纯化的小鼠CK2β亚基［4］构成有活性的全酶,将这两种蛋白按不同的摩尔分子比在体外直接简洁地混合,结果显示，加入小鼠纯化的重组CK2β亚基后CK2的活性明显增加,在α′与β亚基等摩尔混合后其CK2活性是单独CKα′亚基活性的近8.7倍,但再增加CK2β的量并不能导致CK2全酶活性的进一步增加(表1).表1小鼠CK2β亚基对CK2α′亚基酶活性的激活

2.3.2重组小鼠CK2全酶的性质鉴定以酪蛋白、组蛋白和Poly(Glu:Tyr，4∶1)分别作为底物时测CK2全酶活性的结果显示，重组CK2全酶(CK2α′+CK2β)可以将去磷酸化的酪蛋白作为底物，而不能以组蛋白和TPK的底物Ploy(Glu:Tyr)作为底物.以组蛋白和TPK的底物Ploy(Glu:Tyr)作为底物时，CK2全酶的活性不到以酪蛋白为底物时的20%.

在以酪蛋白为底物的同时，分别加入肝素、CK2特异性抑制剂5，6二氯1β呋喃糖苯并咪唑(DRB)，精胺，Ca2+，cAMP和cGMP后测定CK2全酶的活性的结果表明，重组CK2全酶的活性受肝素和DRB的抑制，能被精胺激活，而其次信使分子的Ca2+，cAMP和cGMP则对CK2的活性没有影响(表2).

2.3.3纯化的单独CK2α′亚基和CK2全酶(CK2α′＋CK2β)的动力学依据HanesWoolf作图法作出回归直线,得出的单独CK2α′亚基对ATP的米氏常数（michaelisconstant,Km）值和最大反应速度(maximumvelocity，Vmax）值分别为12.6μmol/L和31.0nkat；对GTP的Km值和Vmax值分别为31.7μmol/L和28.7nkat；CK2全酶对ATP的Km值和Vmax值分别为3.6μmol/L和155.2nkat；对GTP的Km值和Vmax值分别为4.3μmol/L和60.0nkat.结果表明，CK2α′亚基和CK2全酶，均可利用GTP作为磷酸供体.单独CK2α′亚基显示出对ATP的Km值小于对GTP，

重组小鼠CK2α′亚基的GST融合表达、纯化及活性测定

而CK2全酶对两者的Km值相像，说明单独CK2α′亚基对ATP的亲和力大于对GTP，CK2全酶对两者的亲和力相像.而CK2全酶对ATP和GTP的Km值均小于单独CK2α′亚基，说明全酶对ATP或GTP的亲和力明显强于单独CK2α′亚基对ATP或GTP的亲和力，且其活性较单独CK2α′亚基均有提高.单独CK2α′亚基或CK2全酶对ATP的Vmax值均大于对GTP的Vmax值.表2重组小鼠CK2全酶的性质鉴定

3争论

蛋白激酶CK2是第一个被发觉的蛋白激酶，被认为是21世纪的蛋白激酶和挑战常规的蛋白激酶［5］，但CK2在体内的真正作用及其机制至今仍是个谜.目前获得小鼠CK2α′蛋白存在困难，又缺乏商品化的小鼠CK2α′抗体.因此，表达纯化重组小鼠CK2α′蛋白为进一步系统讨论重组小鼠CK2全酶(α2β2，α′2β2或αα′β2)的一些基本性质,以及外体筛选以CK2α′为靶点的药物和制备其功能封闭性抗体，阐明该酶的作用机制具有非常重要意义.

陈小文等［6-7］的讨论初选用原核表达载体pT77,已胜利地克隆表达纯化了人CK2α，β亚基和小鼠CK2α，β，而利用此载体目前还未能获得过度表达的人和小鼠二种CK2α′亚基，这可能与人和小鼠二种CK2α′亚基cDNA的5′端GC含量比例过高，其mRNA简单形成二级结构有关，从而影响其直接翻译表达.GST融合表达载体pGEX，带有特别强的T7启动子和终止子，其本身表达1个Mr26kuGST蛋白，该系统可以克服转录

与转录后水平对外源基因表达可能带来的不利影响,便于融合基因翻译起始，是一种高效的蛋白表达载体，且便于目的蛋白的进一步分别纯化.我们采纳该系统胜利地对CK2α′进行了原核表达，上清经谷胱甘肽琼脂糖4B亲和析柱纯化，得到具有生物活性的Mr38ku的目的蛋白，其功能和性质与已报道的CK2性质［3］和HL60细胞自然 CK2全都.本试验用GST融合表达方法,将不能在原核表达系统高效特异表达的基因胜利表达，并且融合蛋白经一步亲和层析纯化即可得到的目的蛋白.我们的讨论结