生物化学教学课件：第15章 DNA的生物合成

第15章DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)中心法则DNARNAProteinReplicationTranscriptionTranslation遗传信息的传递，DNA是遗传物质的中心。复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication第一节复制的方式——半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)复制的基本规律一、半保留复制方式DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代DNA中，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全新合成。两个子代DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念:AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义:DNA保守性，是物种稳定的分子基础。原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。二、双向复制复制中的放射自显影图像A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)

。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’三、半不连续复制3

5

3

5

解链方向3´5´3´35´领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leadingstrand)

。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(laggingstrand)

。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。名词术语：复制眼、复制叉、领头链、随从链、半不连续复制、冈崎片段DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication参与DNA复制的物质:底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA母链；引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。一、复制的基本化学反应(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi聚合反应的特点:dNTP为原料；DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3

方向进行。二、复制中的主要酶-DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymeraseDDDP)简称：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合活性2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´3

5

外切酶活性:5

3

外切酶活性:?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性:（一）原核生物的DNA聚合酶主要有三型DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ原核生物的DNA聚合酶﹠1958，Kornberg首先自大肠杆菌分离纯化DNA-polI；﹠在体外，有模板（ssDNA）、引物（DNA/RNA）、dNTP原料存在条件下，合成新链DNA；

3

5

外切酶活性：校读作用

5

3

外切酶活性：可切除RNA引物；﹠延伸速度：20nt/sec；持续合成能力约200bp；﹠约400分子/菌，含量相对稳定，不受细菌生长状态影响；﹠突变株一般不致死，只是对紫外线敏感，但5

3

外切

酶活性缺陷会致死。DNA-polⅠ资料功能：DNA-polⅠ（109kD）参与DNA损伤修复；在复制中起辅助作用。对复制和修复中出现的空隙进行填补。323个氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）正常菌体内很少发现。延伸速度慢：5nt/sec；可连续延伸约1500bp。基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。1999后，还发现DNA-polⅣ、Ⅴ与Ⅱ类似。功能：DNA-polⅢ(250kD)是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA-polⅢ（250kD）主要在细菌生长期出现。细胞内分子数少（约20/菌）。延伸速度极快：1000nt/sec。突变株致死性强。具有两个聚合活性中心。（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种DNA-pol

起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

真核生物的DNA聚合酶三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。（一）DNA聚合酶的核酸外切酶活性与即时校读核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现外切活性。DNApolⅠ的校读功能（二）DNA聚合酶具有碱基选择功能DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：四、复制中的解链和DNA分子的拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态E.Coli基因图解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。DnaB：

是大肠杆菌中主要复制型解螺旋酶，6亚基同聚体。环绕结合于单链DNA，沿5

滑动。其突变致复制缺陷。引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶。大肠杆菌中DnaG起引物酶作用。

单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。

四聚体，有协调效应。重复使用，突变型致死。

108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶复制过程正超螺旋的形成：解链过程中正超螺旋的形成既能水解、又能连接磷酸二酯键。

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶分类：拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制：五、DNA连接酶连接DNA链3

-OH末端和相邻DNA链5

-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式：HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶的作用：DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication第三节（一）复制起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，形成复制叉。2.形成引发体，合成引物。一、原核生物的DNA生物合成DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3

5

3

5

1.复制叉和引发体含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶的复合结构称为引发体。引发体：primasomeE.colioriC:ATrich,245bp三段串连重复，两组反向重复DnaA：四聚体蛋白DnaA辩认结合ATrich，几个DnaA靠拢，似核小体，“揉搓”DNA双链使之解链。SSB：E.coliSSB:177aa同源四聚体，可覆盖32个核苷酸，有强的正协同效应，结合、脱离。3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3'HO5'引物酶2.合成引物（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol领头链的合成：领头链的子链沿着5

→3

方向可以连续地延长。随从链的合成同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长（三）复制的终止

切除引物、填补空缺、连接切口5

5

5

RNA酶OHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

PATPADP+Pi5

5

DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接：复制过程的有序性1.形成复制叉2.生成引物3.DNA片段延长4.消去引物，填满空隙5.DNA片段连接复制过程的整体协调性哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。

复制的起始需要DNA-polα。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。（一）真核生物复制的起始与原核基本相似增殖细胞核抗原（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物－模板链；并且PCNA使polδ获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-polδ通过PCNA的协同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3

-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由polα催化合成。然后由PCNA协同，polδ置换polα，继续合成DNA子链。（二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换3

5

5

3

领头链3

5

3

5

亲代DNA随从链引物核小体真核生物复制叉的延长：切除引物的两种机制（侧翼内切酶）（DNA-polδ）（残留个NMP）RPA——相当于SSB引物：RNA-DNA,由DNA-pol

合成RF-C:帮助PCNA定位于模板上PCNA：三个亚基绕着DNA形成一个滑动夹子,DNA-pol

附着于滑动夹子上，有利于DNA聚合酶在DNA链上滑动。DNA-pol

——填空隙RNaseH1——消引物后留下一个核糖核苷酸FEN1——核酸内切酶（侧翼内切酶）染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物去除后留下空隙。（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

端粒(telomere)

指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。端粒的功能：维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性端粒的结构特点：由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成：随着细胞高分化/衰老——端粒变短肿瘤细胞端粒酶活性奇高，端粒不一定长端粒酶催化作用的爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工目录真核细胞复制特点（以原核为参照）1.受细胞周期调控2.多复制子按时序分批启动，引物、岗崎片段都短些3.DNA片段延长时有DNA-pol

和DNA-pol

交换，较DNA-polⅢ慢，但复制速度更快（多点同时）4.核小体解聚和再装配，组蛋白再利用并大量新合成5.消引物需核内RNA酶和核酸侧翼内切酶，消掉小段DNA6.端粒酶修补末端逆转录ReverseTranscription第四节逆转录酶(reversetranscriptase)逆转录(reversetranscription)

逆转录酶一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录RNADNA逆转录病毒细胞内的逆转录现象:RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链逆转录酶或宿主RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA病毒tRNA作引物逆转录酶(reversetranscriptase)有三种酶活性：

①

RDDP(RNA-dependentDNApolymerase)②DDDP(DNA-dependentDNApolymerase)病毒tRNA作引物③RNA酶活性RNA病毒双链cDNA（前病毒）独立复制、整合致病RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNA:cDNAcomplementaryDNA逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT二、逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)&Repair第五节DNA突变是指“因个别dNMP残基改变导致该片段DNA在结构、功能上的异常变化”。DNA突变也称为DNA损伤(DNAdamage)。一、突变在生物界普遍存在（一）由生物体内部因素导致突变

——自发突变或自然突变

体内因素：DNA复制错误、DNA自身结构的不稳定性、生物体自身产生的活性氧对DNA的破坏

自发突变率：10-9（二）由环境（人为）因素导致突变

——诱变

诱变因素：物理因素：辐射化学因素：自由基、碱基类似物、碱基修饰物、堪入性染料等二、DNA损伤因素及致损机制（一）辐射致DNA损伤

电离辐射

能直接或间接引起被穿透物质产生电离的粒子或射线（α粒子、β粒子、γ射线、X射线）非电离辐射

紫外线和能量低于紫外线的所有电磁辐射

辐射引起的DNA损伤类型

●

碱基脱落

●

碱基破坏

●

嘧啶二聚体形成

●

单链和双链断裂

●

DNA交联等物理因素：紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV（二）自由基致DNA损伤

自由基是指能够独立存在，核外带有未配对电子的原子或分子

自由基的来源

1.电离辐射通过电离和激发产生

2.代谢产生活性氧自由基的作用机制

自由基与DNA之间发生化合反应、脱氢作用和加成反应等

自由基的危害

损伤碱基、核糖、磷酸二酯键。

（三）化学毒物致DNA损伤

碱基类似物与正常碱基类似，导致碱基置换

碱基修饰物修饰碱基某些基团，改变配对性质或阻断配对

嵌入染料

插入碱基对中，使DNA两条链错位→缺失、移码、插入

化学毒物化学因素：三、DNA损伤的分子类型1.碱基和糖基破坏损伤因素去嘌呤作用、碱基修饰剂、自由基、活性氧、紫外线损伤类型碱基丢失/插入、碱基置换、DNA片段缺失/插入2.错配损伤因素

碱基类似物、碱基修饰剂、自发脱氨基错配类型：置换、颠换3.DNA链断裂

损伤因素

电离辐射、化学物质诱导

损伤类型单链断裂、双链断裂（最严重损伤，不能原位修复，易致畸)4.DNA交联

化学物质诱导(如丝裂霉素)损伤因素损伤类型

链内交联

同一DNA链上碱基共价结合嘧啶二聚体DNA链上相邻的两个嘧啶碱基之间共价结合，形式有TT、CT、CC链间交联

不同DNA链之间的碱基共价结合DNA-蛋白质交联DNA与蛋白质以共价键结合DNA交联示意图四、DNA损伤的后果（双重性）（一）生物进化和DNA多态性DNA带来永久性改变即突变。由此产生新的遗传表型——生物进化只改变基因型，不改变表性——DNA多态性（二）致死、致病只有基因型改变的突变形成DNA的多态性DNA空白段或内含子区突变。突变没有可察觉的表型改变，例如在简并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。这些现象也相当普遍。多态性(polymorphism)一词用来描述个体之间的基因型差别现象。五、DNA损伤的修复修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。光修复(lightrepairing)切除修复(excisionrepairing)重组修复(recombinationrepairing)错配修复(mismatchrepair)SOS修复

修复的主要类型：（一）直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤光修复酶(photolyase)

UV（二）切除修复

定义

在多种酶的作用下，先将损伤区域切除，然后利用互补链为模板，合成一段正确配对的碱基顺序来修补

切除方式切除碱基；切除核苷酸碱基切除修复所有细胞中都有能识别受损碱基的糖苷酶，有它特异切除受损碱基，形成去嘌呤或去嘧啶的位点（AP位点）。DNA分子中一旦产生了AP位点，AP核酸内切酶就会把受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开，并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链。糖甘水解酶识别改变了的碱基，把碱基从N-β-糖苷键处切下来，在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点，统称为AP位点。由AP核酸内切酶将受损核苷酸的糖苷-磷酸键切开5‘3‘核苷酸切除修复此修复是细胞对较大片段损伤的修复，是最强大的修复机制，由多种修复