病理学综合实验

病理学综合实验炎症——以青蛙肠系膜观察炎症的血管变化、白细胞游出及血栓形成（一）目的1．通过实验观察炎症发生、发展过程中血管及血流的变化以及白细胞游出血管的现象。2．观察血栓形成及形态（二）实验对象蟾蜍或蛙（三）实验药品与器材林格溶液，0.4%组胺，蛙板，蛙类手术器械，解剖显微镜，（二）方法及步骤1．破坏脑脊髓：用左手握持动物，以食指和中指夹住双侧前肢。捣毁脑和脊髓时，左手食指和中指夹持蛙或蟾蜍的头部，右手将探针经枕骨大孔向前刺入颅腔，左右摆动探针捣毁脑组织。然后退回探针向后刺入椎管内破坏脊髓。2．使蛙仰卧于蛙板上，将一侧腹壁紧贴蛙板致圆孔，并将四足用大头针固定于板上。3．剪开贴近圆孔一侧的青蛙下腹壁皮肤、肌肉等（切口 1.5cm左右），轻轻地将肠系膜拉出，固定于圆孔四周，使肠系膜展开（注意不要拉得过紧，以免血液停滞及血管破裂）。4．透过圆孔，用低倍镜观察肠系膜血管的变化，并记录观察结果。辨别：动脉、静脉与毛细血管，红细胞与白细胞，轴流与边流。加0.4%组胺，然后观察血管血流速度及血管管径变化。暴露一段时间后观察血流速度变化，轴流、边流改变，白细胞靠边、粘着和游出现象。5．选择一中等大小的静脉，用手指挤压，使血流停止 1-2分钟，然后在损伤处以显微镜观察血栓形成及形态结构。肾脏缺血模型的形态学观察实验[目的要求]熟悉实验方法及操作技巧，学会暴露左肾及左肾蒂，分离左肾动脉，将动脉夹轻轻挟住左肾动脉。掌握肾脏缺血时的大体和微观形态学变化。[实验对象]家兔[实验药品与器材]25%氨基甲酸乙酯、生理盐水，福尔马林，二甲苯， 95%、100%乙醇，苏木素-伊红染色液，；兔手术台、哺乳动物手术器械一套、动脉夹。小烧杯、线绳。[实验步骤]1．动物称重，耳缘静脉注入25%氨基甲酸乙酯5ml/kg，行全身麻醉。仰卧固定。2．打开腹腔，暴露肾脏，小心分离肾动脉。3．将左肾动脉结扎一定时间，观察左肾的颜色、大小及切面变化。4．取出肾脏、对切，放入福尔马林内固定，用于病理切片制作，镜下观察肾小管及间质的变化。病理切片制作方法：病理石蜡切片的制作包括石蜡组织块制作、切片制作和染色。其制作过程是：取材T固定T冲洗T脱水T透明T浸蜡T包埋T切片T贴片T烤片T脱蜡T复水T染色T脱水T透明T封藏。（一）石蜡组织块制作1、 取材和固定：固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态，使其与生活时相似，因此要求固定的材料越新鲜越好。处死动物后应立即切取组织块，组织块的大小以厚度不超过5 mm为宜，并快速投入固定液中。固定液有 10%甲醛溶液、Bouin氏固定液、FAA固定液等。固定时间为数小时至24小时（需视组织块的大小而定）。2、 冲洗：经固定的材料，可根据不同的固定液，分别用水或酒精冲洗，以洗去固定液，否则固定液留在组织会有碍染色。3、 脱水：柔软并含有多量水分的组织是不易切成薄片的，故必须增加组织的硬度。石蜡切片法就是使石蜡渗入组织，以达到支持增硬的作用。但水与石蜡是不相混合的，因此，在浸蜡、包埋前须将组织中的水分完全除去，这一步骤即为脱水。常用的脱水剂是酒精。脱水时，先从低浓度的酒精开始，然后，递增浓度，直至无水酒精。具体方法是，将材料经70%酒精^80%酒精^95%酒精（1）^95%酒精（n）~无水酒精（i）t无水酒精（n）,各级酒精1—2小时。脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。4、 透明：酒精与石蜡不能混和，因此，脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明。透明剂既可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡，以利石蜡的渗入。二甲苯是常用的一种透明剂。将脱水后的材料经1:1无水酒精与二甲苯T二甲苯（1）7二甲苯（n）,各级时间为0 .5—2小时，务使组织达到透明为止。5、 浸蜡：将已透明的材料移入熔化的石蜡内浸渍即为浸蜡。其目的是去除组织中的透明剂,而使石蜡渗入整个组织,获得一定的硬度和韧度,以便切成薄的切片。先将装有56-58C石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒定（约58C），切勿太高或太低。然后将透明了的材料放入蜡杯（1）7蜡杯（n）^蜡杯（川）。浸蜡时间视材料大小而定,一般总的浸蜡时间为2—4小时左右。6、 包埋： 将浸蜡后的材料包埋于石蜡中，并使它凝固成蜡块，这一过程称为包埋。包埋常用铜制包埋框，将已熔化的石蜡倒入，随即将已浸蜡的材料放入其中，应注意切面朝下，位置放正。待石蜡全部凝固后，推出蜡块。二）石蜡切片制作用切片机将石蜡包埋的组织块（蜡块）制成适宜厚度的切片，是目前在病理学科中最常用的一种制片方法。切片厚度为一般4-6卩m【切片前的准备】1、修切蜡块切片前应先修块，即切去组织周围过多的石蜡，一般留下约 2mm宽度的蜡边为宜。注意蜡块不能留得太窄，在切片时易损坏组织；蜡边不能留得太多，否则影响展片。室温过高时，可将修好的蜡块放到冰箱中冷却一定时间。2、 切片用品准备（1）切片刀：预先磨好切片刀备用或切片前更换新的一次性切片。（2）载物片：载物片经清洁液、 95%乙醇处理后备用。（3）展片仪：加入温水，接通电源，调整温度。（4）其他用品：准备好毛笔、记号笔、镊子、冰块等。【切片制作过程】以使用旋转式切片机石蜡切片为例：1．将切片刀装在刀架上，后将蜡块装在切片机固定装置上。调整蜡块与刀至合适位置（刀刃与蜡块切面呈5°夹角）旋转式切片机切取组织，是由下向上切，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端（如皮肤组织，应将表皮部分向上。而胃肠等组织，应将浆膜面朝上）。2．左手执手笔，右手旋转切片机旋转轮。先粗切标本，直到暴露出组织最大切面（但对小标本不要修切得太多，以免将整个组织块修切掉）。再连续旋转切出蜡带，左手持毛笔将蜡片带下端轻轻托起，右手用镊子夹起蜡带上端，正面向上放入展片仪水盒内，展片温度根据使用的石蜡熔点进行调整，一般水温为45C左右，待蜡片带中的组织展平后，即可进行分片和捞片。对于展片困难的切片经30%的乙醇初展后，再用载玻片捞起蜡带放人展片仪水盒内可使切片更易展平。在夏季切片时可用冰块冷却切片刀和组织块，减少切片刀与组织块在切片过程中产生的热时，使石蜡保持合适的硬度以利于切片。3．捞起切片后，写上编号。捞片时注意切片的位置，一般切片的中心位于载物片右侧 1/3与2/3交界处为佳，并注意整齐美观。4•烤箱60C左右烘烤切片30min，对血凝块和皮肤组织应及时烤片，烤片温度应稍低；脑组织切片捞出后直立晾干，再烤片，否则产生气泡。三）染色染色剂多为水溶液，故染色前必须先经脱蜡、复水等步骤。染色方法较多（详见病理学小知识之一、之二），H.E.染色法最为常见，步骤：1、 脱蜡：将烤干的切片放入二甲苯（I）t二甲苯（n）中，各为5min,以溶去切片上的石蜡。2、复水：是将脱蜡后的切片经各级浓度酒精逐渐下降到水的过程，即将二甲苯 （n）中取出的切片移入无水酒精^95%酒精^80%酒精^70%酒精t蒸馏水，各级中停留1—5 min。3、 染色：⑴、将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中5—10min，使细胞核着色。⑵、用自来水洗去切片上残余的染液。⑶、用1%盐酸酒精分色数分钟。分色时就是褪去细胞质不应着色部分的颜色，而使细胞核着色得清晰适度。分色时需随时用显微镜检查切片，使分色适度。（4） 、入1%氨水或自来水浸洗，使之返蓝。（5） 、在蒸馏水中浸片刻。（6）、0.5%伊红酒精溶液中染色2—5min,使细胞质着色。4、 脱水：切片依次入95%酒精（I）t95%酒精（n）t无水酒精（I）t无水酒精（n），各级（中停留1—5