quechers-分散固相萃取-高效液相色谱法测定鱼中氟喹诺酮类药物

quechers-分散固相萃取-高效液相色谱法测定鱼中氟喹诺酮类药物

氟乙醇（fqs）药物属于抗高血压药物，广泛用于预防和处理动物和鱼类疾病。但是由于缺乏相应的科学理论指导,药物的滥用现象较为严重,这不仅使得生物体产生耐药性,而且药物在其中积累残留,对人体健康构成威胁。水产品作为日常膳食中蛋白质的重要来源之一,控制其兽药残留水平对于人体健康至关重要。因此,迫切需要建立一种快速高效的兽药残留检测方法,以便加强水产品质量安全监测。目前,提取动物组织中FQs的前处理方法主要是沉淀蛋白质结合固相萃取(SPE)净化[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11],此类方法操作繁琐且耗时,并不适用于快速检测。Stubbings和Bigwood在QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,RuggedandSafe)前处理技术的基础上,采用乙腈为提取剂,分散固相萃取(DSPE)净化,虽然操作简便,但提取率并不理想。本研究旨在QuEChERS技术的基础上建立一种新的前处理方法,满足水产品中FQs药物残留的快速、简便和高效检测。1实验部分1.1化学试剂及试剂Agilent1100高效液相色谱仪,配有荧光检测器;OL-861漩涡震荡器;Hitachi20PR-520制冷高速离心机;UPWS-超纯水系统;氮气钢瓶及氮吹装置。依诺沙星(EO)、诺氟沙星(NRF)、盐酸环丙沙星(CPFHCl)和恩诺沙星(ERF)(纯度>98%,浙江国邦药业有限公司);乙腈(色谱纯,上海陆都化学试剂厂);冰乙酸(分析纯,江苏强盛化学有限公司);浓盐酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);柠檬酸(分析纯,天津市瑞金特化学品有限公司);三乙胺(化学纯,上海试剂三厂);CleanertC18、NH2和PSA(20～40μm,AngelaTechnologies);超纯水(自制)。1.2荧光分离器vd色谱柱:ChromatoraxC18column(4.6mm×150mm;5μm)。流动相:0.05mol/L柠檬酸—乙腈(V/V,82∶18),三乙胺调pH至3.5。流速:1.0mL/min。柱温:30℃。进样量:20μL。荧光检测器,激发波长:280nm,发射波长:360nm。此条件下,4种FQs能在短时间内得到有效的分离(见图1)。1.3标准溶液配制FQs标准储备液:精密称取盐酸环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星和依诺沙星标准品各10mg,5mmol/L/LHCl溶解并定容至100mL,置于4℃冰箱内保存,4种标准储备液的质量浓度均为100μg/mL。FQs混合标准工作液:移取上述4种标准储备液各1mL于同一10mL棕色容量瓶中,超纯水稀释并定容,配制成质量浓度均为10μg/mL的混合标准工作液。然后用流动相稀释为5、10、20、50、100、200、500ng/mL的浓度梯度。1.4稀盐酸+乙腈离心法取新鲜鱼脊背肉样品进行匀浆,置于-20℃冰箱内保存备用。准确称取2.5g鱼脊背肉样品,置于15mL离心管中,加入1mL稀盐酸(0.15mol/L)漩涡1min。再加入9mL乙腈(1%乙酸)涡旋1min,4000rpm离心8min。取上清液加入200mgPSA,漩涡1min,离心,取上清液,50℃氮吹,2mL流动相定容,过0.45μm微膜,滤液供HPLC检测。1.5通过国家标准方法测定鱼类中的fqs药物含量参考国标方法,对鱼肉中4种FQs药物进行了检测。2结果与讨论2.1乙腈1%乙酸的提取根据文献报道,FQs更易溶于酸性提取剂中。故本研究采用不同浓度的乙腈-水溶液和乙腈-酸溶液作为提取剂,并进行对比(见表1)。结果显示,含1%乙酸的乙腈提取效果远大于纯乙腈,这也和文献报道相一致。当在乙腈和乙腈(1%乙酸)中分别加入不同比例的水和稀盐酸时,提取效率顺序为:90%乙腈(1%乙酸)-盐酸溶液>90%乙腈(1%乙酸)-水溶液>90%乙腈-水溶液;并且90%乙腈(1%乙酸)-盐酸溶液>75%乙腈(1%乙酸)-盐酸溶液≈100%乙腈(1%乙酸)。所以最终选择90%乙腈(1%乙酸)-盐酸溶液作为提取剂。2.2不同固体颗粒净化能力的比较对于鱼肉中的FQs药物残留,目前采取的净化方式主要是SPE和DSPE净化。SPE方法设备比较昂贵,且会造成实验重现性降低。本实验采用DSPE净化法,比较了CleanertC18、NH2和PSA固体颗粒对FQs药物的吸附作用强弱和净化能力大小。结果(表2)表明:C18虽净化能力很强,但对FQs有一定的吸附作用;NH2和PSA对药物的吸附极小,可忽略不计,但两者相比,NH2净化能力较弱,且残留基质可影响检测回收率;故最终选择PSA作为净化剂。图2和图3分别为PSA做净化剂时,鱼肉样品色谱图和鱼肉加标样品色谱图(以鲤为例)。2.3药物检出限、测定下限将所配制的系列浓度混合标准溶液,经高效液相色谱测定。各药物的检出限为三倍基线噪音对应的浓度。线性范围、回归方程(y为峰面积;x为质量浓度,ng/mL)、相关系数以及检测限见表3。2.4不同添加水平的fqs兽药残留测定根据以上讨论,选择90%乙腈酸溶液作为提取剂、PSA作为净化剂,以鲤和鲅为研究对象,来提取鱼肉样品中不同添加水平的FQs兽药残留,并与国标法做了比较(表4)。实验结果证明,改进后的QuEChERS前处理方法不仅简便快速,而且4种药物回收率较国标法均有很大提高,且均能达到80%以上。3psa的提取本研究在QuEChERS前处理技术