蛋白激酶m抑制剂对可卡因诱导的复燃行为的影响

蛋白激酶m抑制剂对可卡因诱导的复燃行为的影响

药物中毒是一种慢性的高复发性脑疾病，其特点是强迫服用药物并将其吸收。反复使用成瘾药物之后,可以在成瘾药物产生的奖赏效应和中性用药环境之间产生一种强烈的关联性记忆,并最终导致强迫性用药和觅药的持续存在。动物实验和临床试验都表明,成瘾形成过程中的关联性记忆对于成瘾性行为的发展和保持都发挥着至关重要的作用,可能是戒断后心理渴求长期存在的基础。研究成瘾性记忆的神经生物学机制有助于理解戒断后复吸的发生以及促进药物成瘾的治疗。巩固下来的记忆如果再次暴露于中性刺激而没有相应药物强化,记忆又会处于一个不稳定的阶段,易于被外界因素干预,这个阶段称为再巩固。大量研究表明,在记忆的再巩固阶段进行干预,可以有效破坏成瘾性记忆,降低心理渴求和复吸行为。但由于使用的干预方式及工具药物的毒性限制,这些研究要应用到临床上还存在诸多困难。消退训练是将成瘾者反复暴露于中性刺激而没有药物强化,从而在中性刺激与缺少药物强化之间建立起一种新的关联性记忆。这种干预方式只能暂时性的降低由中性刺激诱导的心理渴求所导致的复吸,对原有的成瘾性记忆并不能够抹除。近来,Monfils和Schiller分别在动物实验和临床试验中发现,在唤起之后的再巩固时间窗内进行消退训练,通过干扰记忆的再巩固过程改写原有的记忆印记可以永久性抹除对条件性线索的恐惧反应。这种非药理学干预手段称为“唤起-消退”训练模式。我们实验室前期研究也发现,在成瘾大鼠和海洛因吸食者中,唤起-消退训练也可以有效降低渴求,预防复吸。但其潜在的神经生物学机制目前还不清楚。蛋白激酶PKMζ是蛋白激酶C的一种亚型,它缺少N-末端的调节功能区,具有持续性激活的特性。PKMζ分布于多个脑区,包括岛叶皮质、海马和杏仁核等,通过增加突触后AMPA受体的数量来增强兴奋性突触传递。大量研究证实PKMζ是一种维持长期记忆的分子,在空间记忆、条件性味觉厌恶记忆和恐惧记忆的维持中发挥重要作用。此外,PKMζ还参与消退记忆的维持。研究发现,下边缘皮质IL内PKMζ在维持吗啡成瘾记忆和吗啡戒断厌恶记忆的消退过程中均发挥重要调节作用。我们前期研究也发现,唤起-消退训练可增高IL-mPFC脑区的PKMζ蛋白表达。在本实验中我们采用大鼠SA模型,以下边缘皮质IL-mPFC为目标脑区,PKMζ抑制剂ZIP作为工具药,研究唤起-消退训练在药物成瘾治疗中的潜在应用价值,并进一步探讨其相关的分子机制。1材料和方法1.1动物分组、给药及数学模型Sprague-Dawley(SD)大鼠,♂,购自北京大学医学部实验动物中心,许可证编号:SCXK(京)2006-2008,体重240-260g。动物房恒温、恒湿(温度23℃±s2℃,湿度50%±s5%),采用12h昼夜节律控制(8:00-20:00)。实验开始前,动物在动物房适应5-7d,自由饮水,进食。开始实验时,大鼠重300-320g。大鼠接受的所有操作均符合实验动物伦理学,遵循国家和北京大学医学部动物使用和保护委员会颁布的条例。大鼠自我给药训练箱系宁波Anilab,箱底部上方9cm有两个鼻触装置(nose-poke)。动物触碰有效鼻触(activenose-poke)装置会引起静脉给药并伴随5s的灯光-声音条件线索,同时动物触碰有效鼻触的次数会被电脑同步记录下来,触碰无效鼻触(inactivenose-poke)的次数也会被记录。动物颅骨上固定的自我给药套管通过橡胶管与给药泵相连。软管外有金属弹簧保护,顶端与旋转轴承相连,以确保动物在自我给药训练箱中的正常活动不受影响。1.2静脉和对照药给药盐酸可卡因,购自青海制药厂。可卡因溶于生理盐水,浓度为5mg·ml-1,每只动物每次触碰有效鼻触按照0.75mg·kg-1静脉给予可卡因。PKMζ抑制剂ZIP(货号:63361,ANASPEC公司,美国)以及对照药sZIP(货号:63695,ANASPEC公司,美国)溶于0.1MPBS,浓度分别为30nmol·ul-1。核团微注射给药时,将与微量注射器相连的针头插入头上埋好的管内,固定。以0.5ul·min-1的速度,推药1min,并停留1min。将其从大鼠头上取下,并盖好套管的帽。1.3目标脑区和单笼饲养大鼠大鼠经50%戊巴比妥钠(腹腔给药)麻醉后,仰卧位将静脉插管置于右侧颈静脉,插管尖端位于右心房开口处。静脉插管固定后经皮下穿过耳后置于颅骨上方,与静脉自我给药套管相连。静脉插管完成后将大鼠置于脑立体定位仪上(俯卧位),用耳棒在水平方向固定好大鼠。将大鼠头顶颅骨结缔组织刮干净,并用止血弯夹暴露颅骨。用电钻钻3个孔,拧紧螺丝。记录前囟点的数值后,计算目标脑区坐标,移动套管臂将套管埋入目标脑区上方1mm处。IL-mPFC的坐标参考本实验室之前的研究:AP,+2.9mm;ML,±1.0mm;DV,-4.8mm(见图1)。套管偏离中心线角度调整为6°以避开侧脑室。自我给药套管和核团给药套管经不锈钢螺丝和牙科水泥均固定于颅骨上,待水泥干燥后即可将大鼠取下。将大鼠单笼饲养,术后大鼠体重恢复至手术前即可进行实验。并每天注射青霉素以防止静脉给药套管堵塞或发生感染。1.4sa行为实验1.4.1动物单次给药后fr1大鼠进行10d的可卡因(每次触碰有效鼻触给药量为0.75mg·kg-1)自身给药训练,训练在大鼠的夜间周期进行,每天3h,每小时之间休息5min。训练采用FR1强化程序,每次给药之间有40s的不应期。每个训练期以笼灯开启为信号,动物触碰有效鼻触后笼灯关闭,不应期结束后笼灯再次开启。为防止动物给药过量发生死亡,每小时可卡因给药次数限制在20次,即20次之后电脑只同步记录有效鼻触次数并不静脉给药。训练结束后,根据训练期间的给药次数对动物进行分组,每组动物给药次数均值之间没有差异。1.4.2唤醒实验方法同训练过程,但是触碰有效鼻触不给予可卡因,暴露时间为15min。1.4.3身给药之外的同训练过程消退训练过程中,除了动物触碰有效鼻触时不引起可卡因自身给药之外,其他同训练过程。可卡因动物进行消退训练直至触碰有效鼻触的次数降低到基线值的20%以下(基线值为自身给药训练最后3d的均值),且维持至少2d。1.4.4触拉有效鼻触的测试测试前给予点燃剂量的可卡因腹腔注射(5mg·kg-1,i.p.),5min后将大鼠放入自我给药箱中测试。除了触碰有效鼻触不引起可卡因给药外,测试时的条件与训练期间相同,触碰有效鼻触会引起与训练期间相同的灯光-声音条件线索。测试过程中笼灯开启。测试时间为1h。由电脑同步记录测试期间动物触碰有效鼻触或无效鼻触的次数。1.5动物的基本情况首先,对大鼠进行10d的可卡因自身给药训练。形成稳定的可卡因自身给药行为的大鼠随机分为没有组间差异的两组:(1)消退组:每天进行195min消退训练;(2)唤起+消退组:先将大鼠放入训练箱中15min中(即短暂的记忆唤起),然后取出放回饲养笼中10min,然后再将其放到训练箱中进行180min消退训练。所有大鼠进行消退训练,直至两组动物的觅药行为达到消退标准。24h后将两组动物给予不同的处理,即分为以下4组:(1)消退+ZIP组;(2)消退+sZIP组;(3)唤起-消退+ZIP组;(4)唤起-消退+sZIP组。再分别IL-mPFC内微注射ZIP或sZIP。48h后腹腔注射可卡因进行复燃测试(见图1)。1.6统计方法结果以平均值±SEM表示,数据采用重复测量的双因素方差检验分析。P<0.05被认为有统计学意义。2结果2.1il-mpf脑区域定位嵌入方案2.2复燃测试行为对消退训练过程以及复燃测试数据采用重复测量的双因素方差检验分析。对自身给药消退训练过程进行分析,以是否唤起(唤起-消退组以及消退组)作为组间因素;以消退天数(1-12d)作为组内因素。分析结果显示,唤起与否(F(1,25)=10.98,P=0.003)以及消退天数(F(11,275)=72.36,P<0.01)对有效鼻触次数有显著影响,而二者存在显著交互作用(F(11,275)=4.01,P<0.01)。对复燃测试行为学进行数据分析,以是否经历过唤起(唤起-消退组以及直接消退组)和ZIP注射(ZIP和sZIP)作为组间因素;以测试时间点(最后一次消退训练,复燃测试)作为组内因素。结果显示唤起与否(F(1,25)=21.24,P<0.01),是否ZIP注射(F(1,25)=9.38,P<0.01)以及测试时间点(F(1,25)=67.12,P<0.01)对有效鼻触次数有显著影响,且存在唤起×测试时间点(F(1,25)=21.47,P<0.01)以及ZIP注射×测试时间点(F(1,25)=8.21,P<0.01)的显著交互作用。这些结果表明,在再巩固的时间窗内进行自身给药消退训练可以使觅药行为的消退速率明显加快,降低低剂量可卡因引起的觅药行为的复燃。IL-mPFC给予PKMζ抑制剂ZIP可以增强。3抗恶性药物实验本课题研究了下边缘皮质PKMζ在唤起-消退训练降低可卡因诱导的觅药行为复燃中的作用。结果发现:(1)与直接消退训练组相比,唤起-消退训练的消退速率明显加快,并且能够显著降低消退训练后低剂量药物引起的觅药行为的复燃;(2)药物点燃之前在下边缘皮质IL微注射PKMζ抑制剂ZIP,可以增强直接消退训练组以及唤起-消退训练组可卡因诱导的复燃行为。自身给药模型是成瘾研究中最常用的模型之一,动物通过主动的操作性行为获得药物强化,能够很好地模拟人类药物成瘾的过程。大量研究表明,破坏药物的再巩固过程和增强消退记忆都能够降低动物的药物渴求和觅药行为,但由于各自的局限性均不太适用于临床。唤起-消退训练是在再巩固的时间窗内进行消退训练,之前关于恐惧记忆的研究表明这种非药理学干预手段可以有效的降低动物和人的恐惧反应。在我们的前期研究中发现,唤起-消退训练能够显著降低药物诱导的可卡因以及海洛因觅药行为。在本研究中,我们发现,与直接消退训练组相比,唤起-消退训练组大鼠的消退速率明显加快;与消退+sZIP组相比,低剂量可卡因在唤起-消退+sZIP组大鼠引起的药物渴求行为明显降低,表现为有效鼻触次数下降,但并没有完全阻止,这与本实验室之前的研究结果一致。这种唤起-消退模式对觅药行为的影响并不是由于人为操作因素(如将大鼠取出或者放入训练箱)影响记忆的再巩固,因为我们之前的研究表明,唤起和消退之间的时间间隔为6h时,虽然动物也会经历同样的操作,但对可卡因觅药行为的复燃却没有影响。同时前期研究发现,唤起-消退之间的时间间隔为10min或者1h,而非6h,才会产生抑制觅药行为复燃的作用。这表明唤起-消退模式也不是简单的间隔消退训练。操作性训练是一个包含操作性行为应答和条件性反应的复杂过程,可能通过主动的操作性行为获得的药物强化要高一些,唤起-消退训练只能够降低大鼠的觅药行为并不能完全阻止。可能是由于操作性记忆比巴甫洛夫形成的条件性记忆要牢固一些,其再巩固过程不易被破坏。唤起-消退训练是在再巩固的时间窗内进行消退训练,这个过程中发生了再巩固过程的破坏还是消退记忆巩固过程的增强,又或是二者兼有。可卡因CPP的研究表明,唤起-消退训练能够完全阻止大鼠消退训练后低剂量药物引起的CPP复燃以及自发恢复,表明原有的记忆印记可能在再巩固过程中被破坏了或者被重新改写了。关于恐惧记忆的一些研究则表明,增强消退记忆的巩固过程同样可以抑制恐惧记忆的再现和自发恢复。近来,有研究表明,PKMζ参与了长期滥用药物导致的中脑边缘多巴胺系统神经可塑性改变,基底外侧杏仁核BLA内的PKMζ在奖赏记忆维持中有作用而下边缘皮质IL内的PKMζ参与了消退记忆的维持。同时唤起-消退训练可以使BLA内PKMζ表达量下降而IL内PKMζ表达量上升,唤起-消退训练可能同时涉及两个记忆过程。本实验中,我们以IL为目标脑区来进一步探讨潜在的分子机制。我们发现与直接消退+sZIP组相比,在药物点燃之前IL内微注射PKMζ抑制剂ZIP,可以增强可卡因诱导的觅药药行的复燃,这进一步验证了我们前期的研究发现,即下边缘皮质IL内的PKMζ参与了消退记忆的维持,应用PKMζ抑制剂可以消除消退记忆对原来记忆的抑制作用,使原来的奖赏记忆重现。更重要的是,我们还发现,与唤起-消退+sZIP组相比,在药物点燃之前其IL内微注射PKMζ抑制剂ZIP,部分逆转了唤起-消退训练对于大鼠觅药行为的降低作用。这表明消退-训练所产生的效应部分是通过IL脑区的PKMζ所维持的,进而支持了唤起-消退训练可能是通过增强消退记忆的巩固过程发挥作用的假设。不过,微注射ZIP后,两组动物在点燃测试中表现出差别,这种差别也可能是由于给予ZIP后的其药物记忆就已经部分恢复,需要进一步实验证实。同时,以前的研究表明,ZIP只抑制PKMζ的活性而对再学习没有影响,说明这种作用并不是由于异体蛋白注射诱发的局部炎症反应造成的。目前认为,PKMζ可能是一种记忆分子,介导了记忆的长期维持。PKMζ通过调节NSF/AMPA受体的转运在晚期LTP当中发挥重要作用,ERK和PKA等激酶