肝素酶发酵车间工艺设计方案

年产110吨肝素酶发酵车间工艺设计摘要肝素酶指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，被用于去除血液中的肝素，测定肝素的构造，以及抗肿瘤等医学方面的研究。国外对肝素酶的研究已有40数年历史，涵盖菌种筛选、发酵产酶、分离纯化、克隆体现等领域。我国起步很晚，现在仅见中科院（北京）微生物研究所和四川大学有有关肝素酶研究的报道。 现在世界上研究最多、最进一步的肝素酶仍然由肝素黄杆菌发酵生产而来。本文通过肝素酶发酵工艺的研究，涉及灭菌工艺研究、提取工艺的研究、浓缩和干燥工艺研究及成型工艺研究，将其研制成工艺切实可行、质量稳定可控的酶制剂。并对肝素酶制剂车间生产工艺进行研究，对工艺流程、物料衡算、热量衡算、车间布置、管道布置、三废解决、设备造型等核心工艺进行设计，为肝素酶车间工艺的设计提供根据。b5E2RGbCAP核心词：肝素酶；车间布置；工艺流程图AbstractInthesepiecesisinundertheguidanceofTCMtheory,combinedwithclinicaldoctorstheapplicationandselectedclinicalexperienceformanyyears,hasqingrejiedu,spleenandstomach,invigoratethecirculationofbulge,clinicallyusedforchronicgastritis,gastriculcer,accompaniedbyintestinalmetaplasiaatypicalsymptoms.Hisownbythese,spreadinghedyotisherb,rhizomacoptidis,etcoftenherbs,ofwhichoneoftheseforhisowngentlemanmedicine,therefore,intheseextractiontechnologyonthebasisoftheexperimentalresearch,theapplicationformofhisownfromthetraditionalone,developedintotakingconvenientoralsolidpreparation,changeonecarryinconvenience,shortcomingsandsoonperishable.Inthisarticle,throughthesepiecesofresearchofpreparationprocess,includingcrushingandsterilizationtechnologyresearch,theextractionprocessofstudy,concentrationanddryingprocessandmoldingprocessresearch,todevelopitintopracticaltechnology,stablequalitycontroloftraditionalChinesemedicinecompoundpreparations.Andinthesepiecestabletworkshopproductionprocess,theprocessflow,materialbalance,heatbalance,workshoplayout,pipinglayout,"threewastes"treatment,equipmentdesignonthekeytechnologysuchasmodelling,providethebasisforthesepiecesworkshopprocessdesipg1nE.anqFDPwKeywords：Heparinase.Plantlayout;ProcessflowdiagramDXDiTa9E3d目录摘要 1..R.TCrpUDGiTAbstract 2..5.PCzVD7HxA1绪论 j.LB6HrnAILg1.1概述 xH6AQX74J0X肝素酶介绍 6..LDAYtRyKfE1.1.2肝素酶的分类及构造 Z6zz6ZB2Ltk肝素酶的稳定性 8..dvzfvkwMI1课题研究的目的意义 r9qyn14ZNXI1.3课题研究内容、设计办法 1.0EmxvxOtOco1.4设计根据及原则 1..0SixE2yXPq52工艺流程概述 1..1.6ewMyirQFL2.1文献报道的合成工艺简述 1.1kavU42VRUs各步生产流程 1..2y6v3ALoS892.4工艺流程框图 1..3M2ub6vSTnP2.5工艺条件及生产安排 1..60YujCfmUCw3物料衡算 1..7.eUts8ZQVRd3.1衡算基准和设计基础数据 1s7QsAEJkW5T年产110吨肝素酶发酵车间物料衡算 1.7GMsIasNXkA4热量衡算 1TI8rRGchYzg热量衡算的意义 1..87EqZcWLZNX对于每一种单元操作进行能量衡算 1.8lzq7IGf02E5设备选型 1zv9pgeqJ1hk发酵罐 2N0rpoJac3v15.2电热蒸发发生器 2..21nowfTG4KI5.3种子罐的设计与选型 2..2fjnFLDa5Zo6管道选型设计 2..3.tfnNhnE6e56.1概述 2Hb3mVN777sL管道设计原则 2V37l4jRB8Hs车间管道设计规定 2..383lcPA59W97车间布置 m2Z4kklkzaaP7.1车间设计的基本原则 2..4AVktR43bpw车间布置设计的目的和重要性 24ORjBnOwcEd车间布置的有关技术规定和参数 242MiJTy0dTT设备的安全距离 2..5gIiSpiue7A设备布置原则 2..6uEh0U1Yfmh7.2车间平面布置 2..7IAg9qLsgBX车间布置平面图 2..7WwghWvVhPE车间产尘的解决 2..7asfpsfpi4k车间排热、排湿及臭味的解决 2o8oeyYZTjj1参观走廊的设立 2.8BkeGuInkxI安全门的设立 2..8PgdO0sRlMo设备的安装 2..83cdXwckm158“三废”解决及其回收运用 2..9h8c52WOngM废气的解决 2.9.v4bdyGious废液的解决 2..9J0bm4qMpJ98.3废料销毁 2X9VauA9grYP9结论及建议 3..0.bR9C6TJscw9.1结论 3pN09LBDdtrd9.2建议 3D0J8T7nHuGT参考文献 Q3F281D7bvUA附录一 43B47a9QFw9h附录二 i3x67iFA8xoX附录三 w3t86qbkCyDE致谢 K4p15zH46zRk1绪论1.1概述1.1.1肝素酶介绍肝素酶是一类能降解肝素类物质的裂解酶。在真核生物中，肝素酶通过水解硫酸乙酸肝素蛋白聚糖(HSPGs)的肝素类侧链破坏细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)的基本构造，释放并激活连接在肝素类侧链上的活性物质，与血管生成、肿瘤转移、炎症等病理过程亲密有关 w。原核生物肝素酶现在重要来源于肝素黄杆菌 (Flavobacteriumheparinum)，在制备低分子肝素(LMWHs)、消除体外循环中的肝素抗凝剂、拟定肝素精确构造等方面有着重要的用途。但是，肝素酶稳定性差、不易提纯，因而价格昂贵，限制了其在医药工业领域的广泛应用。因此，研究和理解肝素酶的构造、性质和生物学特性，对优化肝素酶的工业生产，拓宽肝素酶的应用领域有着重要的意义。Yl4HdOAA611.1.2肝素酶的分类及构造分类肝素酶最初是从肝素黄杆菌(Flavobacteriumheparinum)中被发现和分离的。肝素黄杆菌为一类来自土壤的革兰阴性菌，现在已经从中分离纯化得到 3种肝素酶:肝素酶I(HeparinaseI}EC4.2.2.7)肝素酶II(HeparinaseII，无酶编号)和肝素酶III(HeparinaseIII.EC4.2.2.8)03种肝素酶的重要区别在于相对分子质量(}>、电荷性质及底物特异性的不同。肝素酶I，hfr43.8kD，等电点9.3,能够特异性的切割肝素类分子中6SG1cNS(1-}4)2SldoA之间的连接键；肝素酶III}M}73kD，等电点约为10，能够特异性的切割硫酸乙酞肝素类分子中G1cNS/G1cNAc(1-4)G1cA之间连接键。肝素酶II是3种肝素酶中分子量最大(84.5kD)和底物选择性最宽的一种，等电点约为8.9，对肝素类和硫酸乙酞肝素类连接位点都有切割作用。ch4PJx4BlI序列通过DNA序列分析表明，3种肝素酶是完全不同的基因产物。肝素酶I,II和III的基因分别含有1152bp}2316by和1977by的开放读码框架，编码含有384,772和659个氨基酸序列的蛋白前体，前体表达后在氨基肤酶的作用下发生Edman降解，从A1a21-G1n22,Ser25-G1n26和A1a24-G1n25处分别切去21,25和24个氨基端前导肤序列，形成成熟的肝素酶I、II和III。qd3YfhxCzo糖基化1.2.2糖基化原核生物的本身蛋白发生糖基化的现象是比较少见的，但由肝素黄杆菌分离得到的5种多糖裂解酶(另外两种是软骨素酶AC和软骨素酶B)中只有肝素酶III不存在糖基化位点。肝素酶I糖基化位点在Ser39,连接一种分子量约1.1kDa的糖链hl，序列为Gal-S(1-4)[Gal-a(1-3)](2-0-Me)Fuc-}(1-4)Xyl-S(1-4)G1cUA-a(1-2)[Rha-a(1-4)]Man-a(1-0)Ser,肝素酶II糖基化发生在Thr134,连接一种序列为Man-(Rha)-G1cUA-Xyl的四糖。E836L11DO5催化区域酶与底物的作用机制与酶的构造特别是高级构造亲密有关，现在有关3种肝素酶的二级和高级构造还不清晰。Sasisekharan实验室对其活性中心及底物结合位点作了大量的研究，并对其催化区域进行了考察，找到了某些维持酶催化活性所必需的氨基酸。肝素酶I中处在高度阳电荷环境中的Cy:;135为其活性位点，附近含有两个阳电荷簇(Phe197}Asp204和G1u207'Asp212)含有Cardin-Weintraub肝素结合共有序列，阳电荷簇中的His203对于肝素酶I的催化活性起到核心作用，而 Lys199可能通过稳定底物肝素糖醛酸C-6位的阴离子而直接参与催化反映，同时能够稳定Cys135的疏基而起到协同催化作用.，因此能够推测Cys135,His203和Lys199共同构成了肝素酶I的催化区域，而阳电荷残基Lys198和Lys132对维持催化必需的微环境起到了重要作用。另有研究表明，肝素酶I的活性中心需要一种强的还l系环境，因此加入抗氧化剂(如DTT)有助于提高肝素酶I的活性。肝素酶II中Tyr257,His238,His451和Ilis579残基对酶的催化活性至关重要，但具体催化机制有待于进一步阐明‘}l。在肝素酶III中，His295和His510是维持活性的必需氨基酸。S42ehLvE3M钙结合位点在肝素酶I和III中，钙离子对维持酶的活性起到了重要的作用.肝素酶I中存在两个钙结合基序CB-1和CB-2(Glu207"Val219;Val373"Ala384)，定向突变显示CB-1,CB-2通过不同的作用机制在维持肝素酶I的活性方面都发挥了重要作用。CB-1重要通过影响酶与钙的结合而影响酶的活性，相对于影响钙的结合CB-2更多地通过其它复杂机制影响酶的活性。在肝素酶III中也同样存在两个钙结合基序（Leu390"G1y405;Arg576"Asn591），钙离子可能是通过与底物的特异性区域结合而变化其构象使其更适合与酶结合， 或者钙、底物和酶结合成一种三元络合物而发挥作用.但在肝素酶II中不存在任何的钙结合共有序列，因此钙离子对肝素酶n来说不仅不能激活反而克制酶的活性。501nNvZFis（5）蛋白构造根据3种肝素酶的序列，肝素酶I被列入多糖裂解酶家族PL13,肝素酶m被列入PL12,而肝素酶II由于其独特的基本序列还缺少有效的构造数据将其分类 .Shaya等L47通过分析肝素酶II的晶体构造证明，肝素酶II蛋白有三个区域构成：茫末端区（Gin26}Arg356;14个。螺旋）,中央区（Asp357}Asn676;16个p折叠）和C-末端区（Thr677}Arg772;9个p折叠），类似于PL8家族软骨素裂解酶AC和透明质酸裂解酶，不同的是肝素酶II以稳定的非对称的同二聚体形式存在，两个活性位点各自分居在两个单体上， 其中央区存在一种Zn2+离子，对维持两个位点的结构稳定起重要作用.现在有关肝素酶I和III的立体构造尚未见文献报道。jW1viftGw9肝素酶的稳定性肝素酶的稳定性较差，这一缺点是造成现在尚没有好的方法来获得活性和产量均较好的肝素酶的重要因素。肝素酶I以液体形式寄存在4'C环境下，在很短的时间内活性即减少为原来的50%，而通过一次冻融、一次冻干其活性只能保持为原来的 45%和25%}ZJ.普通状况下，得到纯化的肝素酶需要4~5步的操作，而在这个过程中用现在的制备办法酶的活性损失巨大，产率很难超出10%oMa等通过在发酵中添加氯化钙的办法将活性酶的产率提高到 17.8%，并且发现氛化钙能够作为肝素酶I的稳定剂，在4'C环境下向酶液中添加1mmol•L-'氯化钙2天后活性保持了80%，5天后仍能保持到55%;随着氛化钙加入量的增大酶稳定性进一步提高，加入100mmo1"L'氯化钙2天内未见酶活性减少.但在冻融条件下，需要较高的浓度才干达成稳定的效果.钞亚鹏等尝试了用固定化的办法来增加肝素酶的稳定性，实验表明将肝素酶固定于聚酷载体上，基本上保持了游离酶的理化性质和催化特性，酶的使用半衰期延长了4.4倍.有报道指出向肝素酶中添加牛血清蛋白（BSA）和乳糖也能够增加酶的稳定性。XS0DOYWHLP肝素酶的应用（1）生产低分子肝素低分子肝素是从普通肝素中分离得到低分子量组分，或裂解肝素产生的片段，是新一代肝素类抗血栓药品，较肝素来说其含有生物运用度高、体内半衰期长、出血倾向小、口服易吸取等特点。现在工业生.产低分子肝素的办法重要是化学降解和酶降解法，即使化学降解法工艺流程较简朴，但裂解过程中加入.的强氧化剂等会与肝素中的硫酸基团作用而引发肝素抗凝活性的减少，也破坏肝素的构造，而肝素酶降解法由于其温和的反映条件、不引发肝素构造的破坏、无毒性、易实现生产持续化而越来越得到人们的关注。LOZMkIqI0w（2）体外循环中消除肝素体外循环是治疗许多心脏疾病的外科技术手段，为了避免插入心脏或血管的人工管道引发血凝和形成血栓造成器官栓塞，经常在手术中用肝素调节血液的凝固功效。体外循环结束后，需要用鱼精蛋白来中和加入的肝素，但鱼精蛋白引发的毒性反映涉及低血压、过敏反映、肺水肿、血小板凝集等日益引发医学工作者的重视，而肝素酶I能够在10min内中和肝素，因此能够考虑用肝素酶I替代鱼精蛋白作为肝素的中和剂。但Stafford-Smith等研究表明，肝素酶I逆转冠脉搭桥术后肝素的抗凝作用并不优于鱼精蛋白，有关应用需要进一步的进一步研究。ZKZUQsUJed（3）研究肝素的精确构造和低聚寡糖活性筛选肝素的构造非常复杂，现在对其具体构造研究仍不透彻。通过控制不同的肝素酶解条件，将肝素降解成大小不等的寡糖片断，通过分析寡糖片段，进一步揭示肝素的精确构造。同时可以研究不同大小塞糖的构效关系，进一步筛选含有生物活性的化合物。dGY2mcoKtT（4）药用研究由于肝素酶的多糖裂解特性，其在医药研发领域也有着重要意义。Daud等的研究指出，肝素酶I能够有效地将戊多糖分解成双糖和三糖片断，因此能够作为戊多糖过剂量时的中和剂来使用。肝素酶III能够从细胞表面及细胞外基质中选择性的切割硫酸乙酞蛋白聚糖HSPGs}HSPGs作为P-和L-选择素以及促炎症介质如IL-8的结合位点，从而肝素酶III能够可逆性地消除这些结合位点和炎症介质，通过减少白细胞波动、猫附、外渗来减轻局部缺血再灌注中对组织的损伤。rCYbSWRLIA1.2课题研究的目的意义酶制剂是一种生态型高效催化剂，含有高效、安全、节能、生态和环保等特点，能够有效带动有关领域技术水平的提高，对应用产业开发新产品，提高质量、节能降耗、保护环境含有重要意义，产生了巨大的社会效益和经济效益。酶制剂产业已经成为生物技术领域的前卫产业和21世纪最有但愿的新兴产业之一。国家十一五期间已将酶制剂列为重点发展的领域，将投资几十亿到该产业，建立生产、研发、出口、检测、菌种保藏基地，使中国成为世界酶制剂生产基地和研发基地，