【多肽化合物对肿瘤细胞的检验探究8700字（论文）】

实验数据与结果第3章实验数据与结果3.1多肽化合物的体外表征3.1.1多肽化合物的质谱结果Comp.1：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.63；Comp.2：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.83；Comp.3：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.94；Comp.4：MALDI-TOF:calcM+=2125.9152，obsvd(M+H)+=2127.75。结果表明，我们成功制备合成了所设计的化合物Comp.1、Comp.2、Comp.3，Comp.4。3.1.2多肽化合物的转化率我们通过LC-MS测得在不同时间点，去磷酸化后的三种多肽化合物的转化率。从图2中可以看出多肽Comp.1在4h转化90%左右；Comp.2在1h中后可快速转化60%，之后转化速率降低，在4h后也只能转化74%左右；Comp.3相对其他两组转化得更加缓慢，4h只能转化55%左右。我们猜想这应该是由于不同磷酸化位点，而引起的转化率不同。图3.1多肽化合物的转化率3.1.3临界聚集浓度(CAC)为判断不同化合物的组装能力，采用动态光散射(DLS)分别测定了多肽化合物Comp.1、2、3和4的临界聚集浓度。如图3所示，我们可以得出Comp.1的CAC值最低，在85.7uM左右；CAC值约为89.6μM的Comp.2次之，Comp.3的CAC值约为105.4μM，这可能是由于磷酸化位点的不同而导致临界聚集浓度的差异。与之相比，不带磷酸化的多肽Comp.4的CAC值则更加的高，约为130.7μM。由此可见，Comp.1具有最出色的组装能力。图3.2多肽化合物的CAC图表3.1.4多肽化合物的体外酶响应性研究我们通过透射电子显微镜观察加入碱性磷酸酶(ALP)前后，三种多肽化合物的微观形貌变化，这有助于更好地发现和说明宏观变化的内在因素。图3.3显示，Comp.1与Comp.2的PBS溶液中存在直径6nm~7nm的较为粗短的纳米原纤维结构，而Comp.3的PBS溶液中纳米纤维分布较为疏松。此后，我们将ALP添加到Comp.1、2、3的PBS溶液中37℃孵育，电镜结果显示它们分别形成50nm~70nm左右的纳米纤维，分布致密且有较多的交联节点。图3.3ALP催化前后的多肽化合物的微观形貌3.1.5多肽化合物与EGFR受体的结合如图3.4所示，多肽Comp.1在转化之前的与EGFR生长因子的结合常数为51.44μM,而其他带有不同磷酸化位点的多肽化合物分别为3.11μM、7.52μM，Comp.1约为它们的17倍、7倍，与EGF蛋白结合常数(459.89nM)相比差距较大。由图3.5可得，当加入ALP之后，实现多肽上酪氨酸的去磷酸化，Comp.1组为738μM，明显低于未加ALP的组别，也展现出了与EGF蛋白相似的结合常数。酶促自组装策略可以提高－YHWYGYTPQNVI－与EGFR受体的结合选择性，同时也说明只有在正确的位点才能提高EGFR结合的选择性。图3.4多肽化合物、EGF蛋白与EGFR受体的结合常数图3.5去磷酸化的多肽与EGFR受体的结合常数3.2多肽化合物在细胞水平上对肿瘤细胞的检验3.2.1模式细胞的选择本课题通过商用抗体对几种不同细胞系的胞外碱性磷酸酶ALP与EGFR受体的丰度进行检测，以此筛选并确定最终的模型细胞即最高表达量ALP与EGFR的肿瘤细胞。如图3.6（a）所示，随着时间变化，ALP与底物相应的吸收值增加；同时，在时间点上的斜率越大，说明ALP的相对含量也越大。SCC15、UMI、TSCCA和CAL-27肿瘤细胞的胞外ALP酶含量较高且这四种细胞系ALP含量差异较小，这几种头颈部肿瘤细胞的胞外ALP的含量均高于HUVEC人脐静脉内皮细胞。在图3.6（b）中，左侧是平均荧光强度，右侧是阳性细胞比例(即抗体标记的细胞占总细胞数量的比例)；可以看出TSCCA的EGFR丰度最大，其次是HN4。综合两者ALP与EGFR丰度结果来看，本课题选定TSCCA作为我们的模型细胞，以此与不同的多肽化合物培养从而选择最佳的多肽序列。(a)(a)(b)Cells图3.6(a)不同细胞外ALP与显色底物作用的吸收值；(b)不同细胞中针对EGFR受体的平均荧光强度(左)与阳性细胞比例(右)3.2.2基于TSCCA细胞的最优多肽选择本课题用不同多肽序列Comp.1、2、3、4与该肿瘤细胞进行培养，并检测哪一种序列能在细胞周围有效形成纳米纤维，以此确定最优多肽序列。通过共聚焦显微镜的直观观察，与其他化合物相比，多肽Comp.1荧光强度最高，在TSCCA肿瘤细胞周围聚集，由此推测，不同的磷酸化位点能影响多肽化合物对肿瘤细胞的选择性，而其中Comp.1的多肽序列能更好地在肿瘤细胞实现酶促自组装而形成纳米纤维，因此确定Comp.1作为本课题的最优多肽。图3.7不同多肽化合物培养TSCCA细胞的共聚焦成像3.2.3最优多肽对不同细胞的检测将多肽化合物Comp.1与多种细胞进行培养后，通过流式细胞术验证该多肽化合物对不同的肿瘤细胞或正常细胞的选择性，如图3.8所示，这些细胞所得的MFI很明显高于空白对照，即说明该策略中对不同细胞的EGFR检测的普适性；而其中TSCCA细胞的平均荧光强度最高，也验证了Comp.1对TSCCA细胞的高选择性。图3.8多肽Comp.1培养的不同细胞的平均荧光强度与空白对照结论本课题根据人舌鳞癌细胞TSCCA的细胞膜外过表达碱性磷酸酶(ALP)以及细胞膜上过表达的受体EGFR的特点，将响应ALP的磷酸化酪氨酸(pY)与响应EGFR的多肽序列-YHWYGYTPQNVI-相结合，最终设计与合成能实现酶促自组装的多肽化合物。这种多肽化合物Comp.1可响应细胞外的碱性磷酸酶而发生自组装行为，形成直径约为60nm~70nm的纳米纤维，且与EGFR膜受体结合性良好。在细胞水平上，首先，我们根据EGFR以及胞外ALP的表达量，确定模型细胞TSCCA。由于多肽的封端NBD的荧光性，观察到该化合物能在细胞周围或细胞膜表面进行原位自组装形成纳米纤维，从而确定多肽Comp.1具有良好的胞外富集度，验证了其自组装行为以及在细胞周围的分布情况。另一方面，再将多肽Comp.1与多种细胞进行培养后，通过流式细胞术验证了该多肽化合物对不同的肿瘤细胞或正常细胞的选择性。酶促自组装策略构建了一种能够靶向肿瘤细胞的纳米材料，并能通过荧光分子实现肿瘤细胞的高选择性检测，可为个性化医疗提供相应的理论支持。本课题结合多肽合成、纳米材料、细胞工程等学科领域，体现出交叉学科的特点，拓宽了基于多肽自组装材料的应用范围，为制备新型纳米药物递送体系开发了新的策略与研究方向。尽管有许多开创性工作已证明了酶促自组装策略在制备超分子纳米材料中的重要性，但仍然面临各种挑战。为了实现酶促自组装原位形成纳米材料，大多数工作都是在肿瘤细胞上进行的，因此在后续实验中，还可通过识别在其他疾病部位表达水平升高的酶来进行自组装，开发出对这类疾病的诊断或治疗方法。同时，大多数报道的例子都用一种酶来证明，而由两种酶构建或控制的超分子纳米材料可能对目标细胞和器官显示出更高的选择性，这也要求我们对酶催化多肽折叠和自组装的机理的理解更深。另一方面，还存在着许多其他诱导多肽自组装的方法，若将它们与酶促自组装策略结合，可能会以更可控的方式形成纳米材料。而迄今为止，大多数工作都是在体外进行的，因此，酶促自组装策略的体内应用也待研究。参考文献[1]李沙沙.七甲川菁类比率型荧光探针的构建及其在生物酶活性分析中的应用[D].青岛科技大学.[2]袁礼彬.新型肿瘤血管生成抑制剂来那度胺衍生物的设计与合成[D].北京工业大学,2015.[3]王娟,邹千里,闫学海.肽超分子自组装:结构调控和功能化[J].化学学报,2017,75(10):10.[4]苗小明.具有氧化还原响应性的含硒小分子多肽自组装体系[D].南开大学.2011.[5]张从柔.多肽基纳米材料用于肿瘤的诊断和治疗研