通过高通量药物库筛选挖掘针对金黄色葡萄球菌的新型抗菌药物的研究

金葡)的新型抗菌药物。本研究的类型为实验性研究。金葡临床菌株均于2017年1月至2019年1月分离自中南大学湘雅三医院呼吸科住院患者的痰液标本；通过摇菌培养浮游菌，检测美国食品药品监督管理局(FDA)认证药物库(包含1573种小分子)对金葡浮游菌增殖抑制作用；通过96孔板结合结晶紫染色，检mol/L,初步筛选出218种对金葡浮游菌具有生长抑制作用的小分子。这些小分子以抗感染药物为主，占118种。其次为抗肿瘤药物、抗炎/免疫类药物、神经12、9、8和3种，未分类药物占9种。排除抗感染药物后，针对具有金葡浮游分类药物维生素K3,其抑制率均达99.65%~100%。针对具有金葡生物被膜选得到的51个小分子的MIC。其中，主要包括抗肿瘤药物、心血管系统药物、药物，分别占22、5、3、9、2、5和5种，其MIC分布分别为1.56~50μmol/L、6.25~25μmol/L、6.25~25μmol/L、0.2~50μmol/L、25~50μμmol/L和0.1~12.5μmol/L。综上，通过高通量药物库筛选出的小分子最低抑研发金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus,简称：金葡)是一态性的耐药突变使得MRSA对这些抗菌药物也产生了耐药性[3]。细菌可相互聚集并分泌胞外基质将自身包裹而形成对抗菌药物敏感性降低性高50~5000倍不等[4]。究其原因，一方面是胞外基质的屏障作用抵挡了抗菌药物进入生物被膜内部发挥抗菌作用[5];另一方面，生物被膜内部的细菌药物产生耐受[6]。目前，市场上尚未发现能有效杀灭持留菌的抗菌药物。因量筛选，成功挖掘了针对金葡的有效抗菌药物[7-9]。抗菌药物相关的高通量构复杂、外膜和细胞壁屏障等原因，导致筛选出的抑制剂活性常不如预期[7]。体外生物学筛选主要是通过细菌的增殖表型或较初级的体观性强、成功率较高，但难以完成大规模的筛选，且往往耗时耗力[8]。例如：Kim等[8]通过秀丽隐线虫模型进行高通量筛选实验，发现视黄醇类抗肿瘤药物CD437及其衍生物可通过破坏细菌细胞膜而对金葡及其持留菌发挥显著的杀菌作用。Kumar等[9]发现抗精神病类药物匹莫齐特可通过刺激细菌产生活性 本研究通过对1573种美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)认证小分子进行高通量筛选，试图挖掘对金葡及其生物被膜具有物的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC),对其抗菌效(一)材料美国FDA认证药物库(包含1573种小分子)、二甲基亚砜(dimethylsulemExpress公司；阳离子校正的MueBroth(TSB)肉汤购自上海索莱宝公司；结晶紫染液购自天津化工一厂；96孔(二)方法力阳性菌株LBZ1(甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌)、甲氧西林敏感型金黄色2017年1月至2019年1月分离自中南大学湘雅三医院呼吸科住院患者的痰液标本。所有菌株均通过VITEK2Compact进行鉴定和药敏实验并通过MALDI-TOF质脂平板上37℃过夜复苏两代。药敏实验使用MH肉汤，其他如未特殊说明，实验2.针对浮游菌的小分子药物筛选：挑取LBZ1单个菌落于装有1/3体积TSB肉汤的50ml离心管中，37℃180r/min过夜摇菌增菌(在摇床上摇动以提高细菌增菌的速度)。次日，吸取少量菌悬液至新鲜的TSB肉汤中，根据预实验结果，继续孵育2~4h至对数生长期。用比浊仪将菌悬液调至0.5麦氏浊度(约为1.5备用。向96孔板中，每孔分别加入99μl备用菌悬液，再加入1μlFDA认证库的小分子储存液(存储浓度为10mmol/L),使小分子药物的终浓度为100μmol/L每孔。将1%的DMSO设置为对照组。轻轻混匀后，将96孔板放置湿盒中，于恒温培养箱中37℃静置孵育16~18h后，于酶标仪检测细菌生长浊度，即630nm实验组-OD空白组)(/OD对照组-OD3.针对生物被膜小分子药物筛选：挑取LBZ1单Or/min培养24h增菌(在摇床上摇动以提高细菌增菌的速度)。用新鲜TSB肉汤将菌悬液1:200稀释后，向96孔板中每孔加入99μl菌悬液，再分别加入1μlFDA认证库的小分子储存液，使小分子药物的终浓度为100μmol/L每孔。将6孔板放置湿盒中，37℃静置孵育24h后，弃上清，各孔加入100μl无菌生理盐水，轻轻漂洗3次后弃上清。各孔分别加入100μ10.25%结晶紫溶液，室温静置孵育15min后，弃染液，加入生理盐水继续漂洗3次去除未与生物被膜结合的结晶紫染液。每孔加入100μ195%乙醇溶液溶解结晶紫染液，于酶标仪检测570nm处的吸光度(absorbance,A),即为生物被膜的总量[11]。生物被膜的抑测。即用MH肉汤将小分子药物进行倍比稀释(0.049~50μmol/L),向96孔板培养的单个菌落于生理盐水中，用麦氏比浊仪调为0.5McF后，用MH肉汤1:1000进行稀释，向备用96孔板中每孔分别加入50μl。将96孔板放置湿盒中，35.细胞毒性检测：筛选出的小分子药物的细胞毒性通过CCK-8试剂盒进行检测，其操作步骤严格按照厂商说明书进行。293T细胞培养于DMEM+10胎牛血清培养基中，并于96孔板中每孔加入约5×103细胞，于37℃5%CO2恒温培养箱中继续孵育24h,使细胞贴壁。用PBS漂洗两次后，加入100μl含有系列稀释孔加入10μlCCK-8试剂，孵育1h后，于酶标仪监测450nm处的吸光度，即为细胞的相对活力。计算与未加药的对照组相比较抑制细为半抑制浓度(halfmaximalinhibitory(三)统计学方法采用GraphPad8.0统计学软件进行作图和分析，计量资料用均数±标准差浓度设置为100μmol/L,初步筛选出218种具有金葡生长抑制作用的小分子，心血管系统药物、内分泌系统药物和代谢疾病药物，分别占比18.35%、8.72%、5.50%、4.13%、3.67%和1.38%;未分类药物占比4.13%。2.针对金葡浮游菌抗菌药物的筛选结果：随后，将筛选浓度设置为50μmol/L进行第二轮筛选，共得到51种有抗菌活性的小分子。为确保筛选出小分子的创新性，对抗感染药物进行去除。表1所示为针对金葡浮游菌生长抑制的排名前十小分子，与未加药的对照组相比较其抑制率高达99.65%~100%。这些小分子主要包括抗肿瘤药物β-拉帕醌、氟尿苷、他莫昔芬柠檬酸盐、双盐酸盐色瑞替尼和依托泊苷。其次为神经系统药物马来酸替加色罗、盐酸三氟拉嗪和奋乃静。最后，还包括未分类药物维生素K3。这些药物的分类和原始作用靶点详见表1。药名原始靶点浮游菌生长抑制率(%)β-拉帕醌马来酸替加色罗多巴胺D2受体抑制剂5-HT₂₄受体抑制剂3.针对金葡生物被膜抗菌药物的筛选结果：同时，针对具有金葡生物被膜抑制作用的小分子进行了筛选。为排除小分子对金葡生长抑制而降低生物被膜形成的影响，纳入对浮游菌无抑制作用或抑制作用极小，而对生物被膜形成抑制能力最大的小分子。排名前十的小分子如表2所示。其中，抗肿瘤药物占比最多(50%),分别为醋酸巴多昔芬、水飞蓟宾、厚朴酚、普纳替尼和考比替尼半富马酸盐，其对浮游菌生长抑制率仅为0~7.89%,但对生物被膜形成的抑制率为50.22%~92.95%。其次为神经系统药物(氯苯沙明和盐酸去甲咪嗪)和抗炎/免疫类药物 (沙奎那韦和富马酸卢帕他定),各占2种。最后，还包括1种内分泌系统药物盐酸雷洛昔芬。这些药物的分类和原始作用靶点详见表2。表2美国FDA认证药物库中抗金葡生物被膜活性排名前十的小分子药名原始靶点制率(%)抑制率(%)氯苯沙明富马酸卢帕他定Abl、PDGFRa、VEGFR2、FGFR1和Sre受体内分泌系统药物4.深入筛选针对金葡的新型抗菌药物：通过微量肉汤稀释实验检测了第二轮筛选得到的51个小分子的MIC。其中，主要包括抗肿瘤药物22种，其MIC分布为1.56~50μmol/L(图1A);心血管系统药物5种，其MIC分布为6.25~25μmol/L(图1B);内分泌系统药物3种，其MIC分布为6.25~25μmol/L(图1C);抗炎/免疫药物9种，其MIC分布为0.2~50μmol/L(图1D);代谢疾病药物2种，其MIC分布为25~50μmol/L(图1E);神经系统药物5种，其MIC分布为1.56~50μmol/L(图1F);其他未分类药物5种，其MIC分布为0.1~12.5药临床菌株MSSA1、MSSA2、MRSA1和MRSABB⑥B⑥图1入选小分子对金葡LZB1的MIC值分布图A示抗肿瘤药物；图B示心血管类药物；图C示内分泌系统药物；图D示抗炎/免疫表3初筛MIC<10μmol/L入选小分子的临床菌株验证MSSA1MSSA2MRSA1MRS色瑞替尼内分泌系统药物西咪匹韦五氟利多MRSA的有效治疗已成为全球亟待解决的难题。传统抗菌药物的研发模式往往费时费力，“老药新用”已成为研发新型抗菌药物的有效手段。本项目通过对FDA认证的已上市药物小分子库进行高通量筛选，发现了对金葡及其生物被膜具有显著抗菌活性的非抗菌药物类小分子。并进一步通过微量肉汤稀释实验和CCK-8试剂盒，确定了部分小分子的MIC和IC50值。本实验结果为后续新型抗菌药物的挖掘提供了重要的参考价值。本研究中，筛选出的有效抑制金葡浮游菌增殖或生物膜形成的小分子多数属于抗肿瘤药物。其中，β-拉帕醌、氟尿苷和他莫昔芬柠檬酸盐对金葡浮游菌的氧化氢的合成为氧自由基提供底物而诱导肿瘤凋亡。抑制拓扑异构酶I的活性，通过抑制细胞周期进程来诱导细胞凋亡[12]。β-外，β-拉帕醌对肺癌和黑色素瘤等均具有较好的治疗效果[13]。氟尿苷是一DNA损伤。诸多研究评估了其治疗肿瘤性疾病(例如：结直肠癌肝转移[14]、原发性肝癌[15]和直肠癌[16]等)中的安全性。他莫昔芬柠檬酸盐是一种选瘤的作用[17-18]。对于患有早期雌激素受体阳性乳腺癌的女性，用选择性雌激素受体调节剂他莫昔芬辅助治疗5年可使她们在15岁时死于乳腺癌症的风险降低约三分之一[19]。此外，微摩尔级别的他莫昔芬柠檬酸盐还能有效抑制EBOVZaire和Marburg病毒的复制[20]。因此，β-拉帕醌、氟尿苷和他莫昔治疗帕金森病[21]。然而，由于氯苯沙明的抗胆碱活性较为一般且有更为优化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂[22],同时研究者发现其对新型冠状病毒也有较强的抑制活性[23]。富马酸卢帕他定是一种血小板激活因子和组胺H1双受体抑制剂，并且可以抑制肿瘤坏死因子a的分泌[24]。富马酸卢帕他定可口服，毒副作用极小且作用时间长，可用于治疗过敏性鼻炎和荨麻疹等过敏性疾病[25]。期和生物被膜分散期[4]。这3个小分子在不抑制金葡生长的浓度下即可抑制分散作用[26]。通过CCK-8实验，本研究检测了MIC<10μmol/L的19个小分子对293T细性。而其他17种小分子药物细胞毒性较低，且其IC50值均大于MIC值，这提示研发价值和成药潜力。此外，本研究首先通ZB1对药物库进行了筛选。得到排名靠前的分子后，又纳入了4株临床菌株(包[1]LowyFD.Staphylococcusaure339(8):520-32.DOI:10.1056/NEJM199808203390806.nfections:epidemiology,pathophysiology,clinicalmanifesdmanagement[J].ClinMicrobiolRev,2015,28(3):603-661.DOI:10.11[3]AliAlghamdiB,Al-Joalresistanceinmethicillin-resistantStaphylocdiJBiolSci,2023,30(4):10中华预防医学杂志，2020,54(12):1469-1472.DOI:10.3760/1[5]RuhalR,KatariaR.Biofilmpatternsinnegativebacteria[J].MicrobiolRes,2021,251:126829.DOI:10.1016/andpersistenceinbacteri6(1):15-21.DOI:10.1016/j.chom.2019.06.002.[7]AnAY,ChoiKG,BaghelaAS,etal.Anoverviewofbiologicalandcomputationalmethodsfordesigningmechanism-inforagents[J].FrontMicrobiol,2021,12:640787.DOI:10.3389/fmicb.20[8]KimW,ZhuW,HendricksGL,etal.Anewoidantibiotics18,556(7699):103-107.DOI:10.103[9]KumarS,SandeepK,KumarR,etal.AntimicrobialeffectidebytargetingROS-mediatedkillinginiotechnolApplBiochem,2023,(publishedonlineaheadofprint).DOI:[10]PengfeiS,YaqianL,Laoccusaureusinhighresista79(11):552.DOI:10.1007/s00018-022-04588-5.[11]LiY,SheP,XuL,estemforachieving"1+1+1>3"cheativebreastcancer[J].JNanobiotechnology,2021,19(1):261.DOI:1[13]GomesCL,deAlbuque1.Beta-lapachone:naturaloccuriologicalactivities,toxicityandsynthesis[J].Phytochemistry,2021,[14]WeiN,Zhangithraltitrexed-basedorfloxuridine-basedchemotherapyfor21(4):443-450.DOI:10.1007/s12094-018-1942-0.pirarubicin-basedtranscatheterhepaticarterialchemoembolizationfyrimidinesforcolorectalcancer[JaseinbreastcancerthroughtheMAPK8/Fox0pathway[J].ClinTranslMed,2020,10(1):137-150.DOI:10.1002/ctm2.5.[19]EarlyBreastCancerTrialists'Colomataseinhibitorsversustamoxifeninpremenopausalwomenwithoestransuppression:apatient-levelmeta-analysisof7030womenfromfourrandomisedtrials[J].LancetOncol,2022,23(3)[20]CooperL,Schaferringofestrogenreceptorligandsaspo[J].JMedChem,2020,63(19):11085-11099.DOI:10.1021[21]StrangRR.Aclinicalevaluationof