微生物论文-自来水中细菌总数的测定-2

PAGEPAGE3自来水中细菌总数的测定摘要众所周知，人类的生存离不开水，各种自然界存在的水中常含一定数量的微生物。水中微生物的主要来源是：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中细菌总数可说明被有机物污染的程度，细菌数越多，有机物含量越大。本实验应用平板菌落技术测定水中细菌总数，由于水中细菌种类繁多，他们对营养和其他生长条件的要求差别很大，所以计算出来的细菌总数仅是近似值。目前一般采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板［1］。自来水的微生物学检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。关键字牛肉膏蛋白胨琼脂培养基自来水平板菌落计数技术细菌引言水中微生物含量对该水源的饮用价值很大。一般认为，作为良好的饮用水其细菌含量应在１００个／ｍｌ以下，当超过５００个／ｍｌ时，即不适合作饮用水了。水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断水质的标准，微生物在水中的数量、种类是必不可少的。自来水的微生物学检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。目前城市自来水厂出厂的自来水在微生物学指标上都能达标,不必担心会引起介水传染病的发生。但自来水中的微量有机物看不见、也不会引起急性疾病,在人体内日积月累,产生的远期毒副作用却不容忽视［2］。长期以来，国内多采用异养菌平板计数法(HeterotrophicPlateCounts，HPC)和最大或然数法(MostProbableNumber，MPN)来测定饮用水中的活菌数．但由于饮用水中的贫营养环境有别于传统培养基提供的富营养环境，大多数在显微镜下观察到的细菌不能在传统培养基中生长(Nonculturable)，致使活菌计数结果偏低．近些年来，国外先后应用吖啶橙染色直接计数(AcridineOrangeDirectCounts，AODC)、活菌直接计数(DirectViableCounts，DVC)等方法对饮用水中的细菌总数及活菌数进行快速、直接的镜检计数．一些新的染色方法，如采用5一氰基一2，3一联甲苯四唑盐酸盐(5Cyano一2，3一ditolyltetrazoliumchloride，CTC)、核酸探针(BacLight)等对活细菌计数，都取得了很好地效果．因平板计数法相对简单，本实验即采用本方法，用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板。对自来水用平板菌落技术测定细菌总数从而判断自来水是否符合国家标准，是否受到污染。1材料与方法 1.1.1实验材料自来水1.1.2实验试剂牛肉膏蛋白胨NaCl1mol/LNaOH1mol/LHCl蒸馏水1.1.3实验仪器高压蒸气灭菌锅灭菌培养皿三角烧瓶天平量筒玻璃棒滴液管烧杯等1.2实验方法1.2.1灭菌1.3.1.1首先将内锅层取出,再向外锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。1.3.1.2放回内锅层,并加入用报纸包好的培养皿、三角烧瓶、吸管。1.3.1.3加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺旋，使螺旋松紧一致，勿使漏气。1.3.1.4用电炉加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力上升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa,121℃,20min灭菌。1.3.1.5灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时打开排气阀，旋松螺旋，打开盖子，取出灭菌物品。1.3.2水样的采取放开水龙头使水流5min后，用已灭菌的三角烧瓶接取水样，以待分析。1.3.3制备牛肉膏蛋白胨培养基1.3.3.1称量按培养基配方依次准确的称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在称量纸上，称量后直接放入水中，稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。1.3.3.2溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。1.3.3.3调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。1.3.4细菌总数测定1.3.4.1灭菌吸管吸取1mL水样，注入灭菌的培养皿中。共做四个。1.3.4.2分别倾注溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,并立即在桌上作平面旋摇，使自来水和培养基混匀。1.3.4.3另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基，培养基的量为培养基高度的1/3,作空白对照。1.3.4.4待培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h，进行菌落计数。四个平板的平均菌落数即为1mL自来水的细菌总数。2结果与分析2.1结果测得培养皿中细菌菌落数如下表：平板序号1234对照组菌落数目（个）134687216534自来水中细菌总为（134+68+72+165）/4-34=76个/mL2.2分析由于实验中对照组的菌落数为34个/mL，可见培养基和培养过程中造成了杂菌污染。处理上表中数据知，该自来水中细菌平均数为76个/mL,说明实验过程中有污染，导致结果有误差，但由于小于100个/ml，所以该自来水为良好引用水。2.3讨论在本实验中的空白对照培养基上长了细菌菌落，说明此培养基被污染了，杂菌来源可能是由于：1）培养皿、三角烧瓶、吸管等仪器灭菌不充分；2）灭菌后在空气中放置又落入杂菌；3）无菌操作技术不当，培养基倾入培养皿后没有立即加盖；因此，在制作培养基及培养的过程中要严格杀菌，并严格按照实验步骤认真操作，从而使得结果更加精确［5］。本实验数据表明，实验组与对照组可能受到污染，以至结果存在误差。本实验的成败在于灭菌、无菌操作技术、培养基的温度等方面是否操作正确，因此接种过程务必防止杂菌的侵入。实验过程中，倾注培养基后，培养皿在桌面上做匀速旋转，使培养基和自来水样充分摇匀，若没有摇匀，在培养基中可见一些菌苔。由于菌种在固体培养基上借助重力作用而形成的，所以观察到绝大多数的细菌着生在培养基表面［7］。所以在实验过程中应注意以下几点：（1）接水前若没有用火烧水龙头，就事先打开水龙头让水自由流5分钟以后再接；（2）灭菌后的培养基应迅速、立即倒掉冷凝水，防止其影响实验；（3）当温度在45℃—50℃时，开始迅速倒平板，温度过高会烫死大肠杆菌，过低会使培养基凝固；（5）在倒平板时，右手应在实验台桌面上平晃培养皿；（6）培养基不能反复升降温，倾入培养皿后应立即加盖，且灭菌后不应在空气中放置，以免杂菌混入；（8）数菌落时，只计数较大的菌落，太小的可忽略不计。参考文献［1］陈声明刘丽丽.微生物学实验研究方法北京：人民教育出版社，1982［2］朱建平.我们要喝更健康的水：健康博览2002年05期［3］毛占生，等徽圬染.源饮用水址理[M]北京：中国建筑工业出版牡．1999［4］李根生.干燥培养基恩德制造及