诊断试验实例

粉尘螨过敏点刺诊断试剂的临床诊断试验第一节研究问题和研究背景简介研究对象：前往医院就诊的过敏性哮喘患者和变应性鼻炎等过敏性疾病患者人群。研究问题：用某国内制药公司生产的粉尘螨点刺诊断试剂(以下简称国产粉尘螨点刺诊断试剂或粉尘螨点刺诊断试剂)对受试者是否患有粉尘螨过敏进行诊断，评价诊断的灵敏度和特异度。灵敏度(sensitivity)是在确诊为粉尘螨过敏条件下的试剂为阳性的概率特异度(specificity)是在确诊为粉尘螨不过敏条件下的试剂为阴性的概率粉尘螨过敏诊断点刺诊断试剂的研究背景简介：哮喘病患者和变应性鼻炎都是过敏性患者，不同患者的过敏源往往不同。如果了解患者的过敏源，患者就可以尽可能地避免接触过敏源或远离过敏源，甚至可以针对该过敏源进行积极的脱敏治疗，因此对于过敏性患者的过敏源检测诊断是有非常重要的意义的。据相关文献报道，由于我国的气候、空气污染程度和卫生条件的影响，我国大多数哮喘病患者和变应性鼻炎患者的过敏源是粉尘螨过敏，因此粉尘螨过敏的检测诊断就显得更为重要了。目前临床上进行粉尘螨检测诊断方法通常有二种，一种是通过检测粉尘螨过敏的血清特异性免疫球蛋白IgE（specificityIgE,sIgE）诊断患者是否患有粉尘螨过敏；另一种是国外生产的粉尘螨检测点刺诊断试剂，其商品名为阿罗格点刺诊断试剂(以下均称为阿罗格点刺诊断试剂)，阿罗格点刺诊断试剂是由默克集团Allergopharma公司生产的，据临床使用验证：两种产品均有一定的误诊比例，即：一部分对象根据临床现象可以明确诊断确实患有粉尘螨过敏而用上述某种方法检测为－，因此诊断为未患粉尘螨过敏，这种现象称为假阴性（falsenegativerate，FNR）；也有一部分对象根据临床现象可以明确诊断确实未患有粉尘螨过敏而用上述某种方法检测为＋，这种现象称为假阳性（falsepositiverate，FPR）。据文献报道，假阴性误诊的主要原因并非粉尘螨过敏的严重程度问题，而是主要原因是两种方法能检测的粉尘螨过敏的谱不同（即：粉尘螨过敏的物质范围不同），阿罗格点刺诊断试剂的假阳性误诊的主要原因是受检者本身对检测试剂的非粉尘螨物质过敏，sIgE的假阳性误诊的主要原因是受检者体内的某种物质对sIgE的检测存在某种干扰因素或物质所致。由于本研究为诊断试验，根据灵敏度的定义和特异度定义，需要分别在确诊粉尘螨过敏的人群和确诊为非粉尘螨过敏的人群中进行随机抽样，因此需要确定粉尘螨过敏的诊断标准和非粉尘螨过敏的诊断标准，这种诊断标准要求诊断正确或尽可能正确，可靠性高并且被同行能够所接受的，所以称为金标准（goldenstandard）或相对金标准。第二节研究设计简介为了尽最大可能使本研究粉尘螨过敏组的受试者确实为粉尘螨过敏者，定义本研究的粉尘螨过敏的诊断相对金标准是如果受试者的sIgE检测为阳性并且阿罗格点刺诊断试剂检测同样为阳性，则诊断该受试者为粉尘螨过敏患者；定义本研究的非粉尘螨过敏的诊断相对金标准是如果受试者的sIgE检测为阴性并且阿罗格点刺诊断试剂检测同样为阴性，则诊断该受试者为非粉尘螨过敏受试者。为了估计国产粉尘螨过敏点刺诊断试剂灵敏度和特异度，保证用于估计灵敏度的样本来自于确实为粉尘螨过敏的人群（以下称该样本为粉尘螨过敏组）和用于估计特异度的样本来自于确实为非粉尘螨过敏的人群（以下称该样本为非粉尘螨过敏组），制定下列如下标准（Inclusioncriterion）和排除标准（Exclusioncriterion）：粉尘螨过敏组的入选标准：1)受试者自愿参加本研究并且签订知情同意书;（非成年人由其监护人签订知情同意书）2)受试者必须有过敏性疾病史;3)年龄在4岁～60岁，男女不限;4)血清粉尘螨sIgE浓度检测结果≥0.35kU/L，为1级或1级以上；5) 阿罗格点刺试验结果为（+）或（+）以上；入选粉尘螨过敏组的对象必须均满足上述5条。非粉尘螨过敏组的入选标准：1)受试者自愿参加本研究并且签订知情同意书;（非成年人由其监护人签订知情同意书）2)受试者必须有过敏性疾病史;3)年龄在4岁～60岁，男女不限;4)血清粉尘螨sIgE浓度检测结果<0.35kU/L；5) 阿罗格点刺试验结果为（-）；入选非粉尘螨过敏组的对象必须均满足上述5条。排除标准：1)正在或二周内患皮肤湿疹、皮肤感染、皮炎或外伤者；2)正在或二周内服用免疫抑制剂,抗组胺类药物,β阻滞剂或ACE抑制剂者；正在或四周内服用糖皮质激素；3)正处于哮喘发作期的病人；4)有肾上腺素禁忌症者；5)有重度药物过敏史者；6)有影响药物吸收、分布、代谢、排泄等因素；7)三个月内参加过其他药物试验者；8)妊娠期妇女及哺乳期妇女；9)有慢性胃肠、肝肾疾病和其他严重疾病历史者，或体格检查时发现有不宜参加试验的疾病；10)对研究和方案的依从性差者。符合排除标准中的任何一条的对象都不得入选。终止标准发生不良事件或严重不良事件，经研究者判断不能继续进行试验。剔除标准依从性差，未能方案的规定进行检查或其它违背方案。本研究由上海市三家三级医院的临床试验基地参与，所有参与本研究的工作人员均参加过国家食品药品监督局的GCP培训并获得临床试验资格认证书。诊断试验实施基本程序：所有愿意参加本研究的受检者同时接受阿罗格点刺诊断试剂、国产粉尘螨点刺诊断试剂和sIgE抽血检测，同时接受血压、心率、脉搏、血常规、尿常规、肝功能和肾功能检测。阿罗格点刺诊断试剂和国产粉尘螨点刺诊断试剂的检测结果在受检1小时以后可以获得，sIgE在1周后才能获得。诊断试验药品和使用仪器名称：粉尘螨皮肤点刺诊断试剂规格：粉尘螨点刺试剂，2mL，为粉尘螨代谢培养基提取液；制备单位：浙江我武生物科技有限公司批号：20050102有效期：2年储存条件：2－8℃使用方法：于前臂掌侧皮肤进行皮肤点刺试验阿罗格点刺试剂由默克集团Allergopharma公司出品，具体如下：规格：3mL生产批号：30008047有效期至：2007年4月储存条件：2－8℃使用方法：于前臂掌侧皮肤进行皮肤点刺试验阳性对照，2mL，磷酸组胺甘油生理盐水溶液；为了区分受检者粉尘过敏还是点刺过敏，建立个体自身阴性对照和阳性对照如下：阴性对照，2mL，甘油生理盐水溶液阳性对照，2mL，磷酸组胺甘油生理盐水溶液阴性对照和阳性对照均在于前臂掌侧皮肤进行皮肤点刺试验由于四种皮肤点刺试剂的点刺位置均在前臂掌侧皮肤，因此相对固定部位，并且依次编号，部位1，部位2，部位3和部位4，每个受试者的部位1和部位2依次为阴性对照和阳性对照，阿罗格点刺试剂和国产粉尘螨的点刺部位是按照随机排列方案确定在(部位3,部位4)或者(部位4,部位3)。操作方法每个医院固定一名皮肤点刺操作员和另一名皮试结果检测员，在受试者前臂曲侧面经消毒过的皮肤表面，按照随机排列方案所确定的四种皮肤点刺试剂的点刺部位，自上而下滴阴性对照液、阿罗格点点刺诊断试剂、粉尘螨点刺诊断试剂和阳性对照液各一小滴（20μL左右），每两滴间距离不小于5cm以防止反应红晕互相融合。用一次性消毒变应原点刺针垂直点在每一液滴中，轻压刺破皮肤，1s后将针提起弃去，2－3min后将全部液滴擦去，在20min后由皮试结果检测员观察各点刺位置的皮肤反应并记录，由于皮试结果检测员是不知道随机排列方案的，所以皮试测量是对于各种盲态的。记录用圆珠笔沿风团和红晕的外缘绘两个圆，然后用透明胶带平贴在风团与红晕上，使圈色粘印到胶带上，揭起后贴于心电图记录纸上，测算面积大小。点刺试验要求针刺深度不超过0.5mm。操作正确时，皮肤不会出血，而且深度一致，易于自身或异体对照。诊断结果评定标准根据阿罗格点刺诊断试剂和粉尘螨点刺诊断试剂与阳性对照所致丘疹面积比判定反应级别：比值为阳性对照丘疹0-25%或与阴性对照相同者为（－）；比值为阳性对照丘疹26%-50%者为（＋）；比值为阳性对照丘疹51%-100%者为（＋＋）；比值为阳性对照丘疹101-200%者为（＋＋＋）；比值为阳性对照丘疹200%以上者为（＋＋＋＋）。皮肤点刺以（＋）或（＋）以上为阳性结果.粉尘螨特异性IgE（sIgE）检测采用的仪器为瑞典PHARMACIA公司的UNICAP系统。sIgE分级如下：0级：sIgE＜0.35kU/L1级：0.35kU/L≤sIgE＜0.7kU/L2级：0.7kU/L≤sIgE＜3.5kU/L3级：3.5kU/L≤sIgE＜17.5kU/L4级：17.5kU/L≤sIgE＜50kU/L5级：50kU/L≤sIgE＜100kU/L6级：sIgE≥100kU/L若sIgE＜0.35kUsIgE＜0.35kU/L/L，则作为sIgE阴性，反之若sIgE≥0.35kU/L，则作为sIgE阳性。sIgE结果要在抽血后1周才可获得，而皮肤点刺与sIgE抽血在同时进行，所以皮肤点刺对于sIgE结果而言是盲态的，而sIgE是一个客观指标。即本试验所有带有一定主观的检测指标均是在盲态测量的情况下进行的，所以相对比较客观。sIgE呈阳性并且阿罗格点刺诊断试剂呈阳性并且符合入选标准，不属于排除标准的受检者入组粉尘螨过敏组，sIgE呈阴性并且阿罗格点刺诊断试剂呈阴性并且符合入选标准，不属于排除标准的受检者入组非粉尘螨过敏组。样本量估计：根据文献报道和预试验结果可知，国产粉尘螨点刺诊断试剂的总体灵敏度在90%左右，总体特异度在95%左右，根据临床诊断的要求，容许灵敏度估计误差wse为±5%，特异度估计误差wsp为±4%，因此粉尘螨组的样本量估计为非粉尘螨组的样本量估计为考虑到脱落等因素，取粉尘螨组和非粉尘螨组的样本量均为150人。第三节诊断试验中的统计学预备知识诊断试验中的基本统计分析方法：受试者根据诊断试验的疾病和该疾病的诊断金标准和入组条件，符合患病的入组条件的受试者进入患病组，符合非患病的入组条件的受试者进入非患病组。对于入组的受试者按诊断试验结果也可以区分成阳性组和阴性组。两次判断结果可整理成如下的四格表形式（见表2.1），据此可计算多种评价新的诊断试验的正确性指标。表2.1诊断试验结果与金标准诊断结果的关系诊断试验金标准诊断结果合计患病（D+）非患病(D-)阳性a(真阳性)b(假阳性)a+b阴性c(假阴性)d(真阴性)c+d合计a+cb+dN=a+b+c+d一、灵敏度与特异度1、灵敏度（sensitivity,Se），即该病患者中被诊断试验正确判断为阳性的比例，也叫真阳性率（truepositiverate,TPR），反映了诊断试验正确识别患者的能力，其总体灵敏度为该病患者中被诊断试验正确判断为阳性的条件概率。(2.1)2、特异度（specificity,Sp），即非本病患者中被诊断试验正确判断为阴性的比例，也叫真阴性率（truenegativerate,TNR）。反映了诊断试验正确鉴别非本病的能力，其总体特异度为非本病患者中被诊断试验正确判断为阴性的条件概率。(2.2)3、假阴性率（falsenegativerate，FNR），即患者被诊断试验错误地判断为阴性的比例，即漏诊率，相应的总体假阴性率为该病患者中被诊断试验正确判断为阴性的条件概率。(2.3)4、假阳性率（falsepositiverate，FPR），即非本病患者被诊断试验错误地判断为阳性的比例，即误诊率，相应的总体假阳性率为非本病患者中被诊断试验错误地判断为阳性的条件概率。(2.4)上述四个统计量虽然称为率，实际上它们都是比例（proportion），对它们进行区间估计和假设检验均可参照二项分布的有关理论进行。总体灵敏度的95%可信区间估计为总体特异度的95%可信区间估计为5、阳性预测值（positivepredictivevalue，PV+），其总体定义为条件概率，由Bayes条件概率公式可得到其样本统计量为(2.5)6、阴性预测值（negativepredictivevalue，PV-），其总体定义为条件概率，由Bayes条件概率公式可得到其样本统计量为(2.6)其中患病率为受检人群的患病率，注意不是一般人群的患病率。7、ROC曲线(ReceiverOperatingCharacteristic)的面积，对于诊断指标为连续型变量时，需要选择一个分割点（cutpoint），当这个变量值大于分割点时定义诊断结果为阳性（或者为阴性），反之定义诊断结果为阴性（或者对应为阳性）。因此灵敏度和特异度都与分割点有关，不同的分割点对应不同的灵敏度和特异度。如果定义一系列的分割点，对应有一系列的灵敏度和特异度，以1-特异度为横坐标，灵敏度为纵坐标作线图构成一条曲线定义为ROC曲线图（如图2.1），ROC曲线下的面积反映了不同的分割点对应不同特异度情况下的平均灵敏度并且也等于不同的分割点对应的不同灵敏度情况下的平均特异度。理想情况下，ROC面积等于1（即灵敏度和特异度均为1时的理想状况），但实际作不到，只能接近1。ROC面积越近1，说明分割点的移动对灵敏度和特异度影响就越小，在实际问题中，连续型观察变量的测量存在一定的测量误差，如果ROC面积越接近1，则从另一个方面说明测量误差对诊断结果影响越小。图2.1ROC曲线示意图第四节统计分析计划和数据管理一、病例报告表每个入组对象对应有一份病例报告表(CaseReportForm,CRF)，并且每个对象对应一个唯一的诊断试验号。每个入组对象的所有观察结果必须均记录在CRF，CRF中的每一页均有负责观察的医生签字，每份CRF均有临床负责人签字确认观察结果无误。数据录入与管理由专人复制。二、数据的录入与修改数据录入程序采用Epidata软件。为保证数据的准确性，每份CRF均由两个数据录入员独立进行双份录入，进行校对修改后并随机抽取10％的CRF进行人工检查一遍，考察是否存在数据出错。对CRF中存在的疑问，数据管理员将产生疑问解答表（DRQ），并通过临床监查员向研究者发出询问，研究者应尽快解答并返回，数据管理员根据研究者的回答进行数据修改、确认与录入，必要时可以再次发出DRQ，疑问解答表的修改、询问等均须有记录。三、数据锁定经数据审核并确认建立的数据库正确无误后，由主要临床研究者、粉尘螨生产方、统计分析人员对数据进行锁定(刻光盘封存)。锁定后的数据文件一般不再做改动。若数据锁定之后发现问题，需要修正，必须提出修改数据的申请报告，阐明修改理由，经本研究负责人审核确认签字后方可修改，并作记录连同修改数据报告一同存档备案。四、数据集定义临床诊断分析集：所有的粉尘螨过敏组的入组对象和非粉尘螨过敏组的入组对象，并且每个对象同时具有粉尘螨sIgE检测结果的原始记录、阿罗格检测结果的原始记录和国产粉尘螨检测结果的原始记录，这些记录构成临床诊断数据集。安全集：所有入组对象在本研究区间的所有安全性观察的记录构成安全集。五、统计分析计划1)对粉尘螨过敏组估计灵敏度和95%可信区间2)对非粉尘螨过敏组估计特异度和95%可信区间3)点刺20min后观察各点刺位置的皮肤反应并记录丘疹的面积。以粉尘螨点刺试剂与阳性对照所致丘疹面积比作为连续型诊断评价指标，选择不同的分割点计算相应的灵敏度和特异度并且作ROC曲线，计算相应的ROC曲线下的面积及其95%的可信区间。4)估计各个安全性观察指标的异常率，比较试验前和试验后安全性指标的异常率的差异。5)所有的统计检验均采用双侧检验，P值小于或等于0.05将被认为所检验的差别有统计意义。第五节统计分析的主要结果一、入组情况表2.2病例入组情况阳性组阴性组入组人数脱落人数(脱落率)入组人数退出人数(脱落率)医院1654（6.15%）652(3.08%)医院2654（6.15%）553(5.45%)医院3201（5.00%）303(10.00%)合计1509(6.00%)1508(5.33%)二、脱落人员的情况(省略)三、受试者基本情况表2.3人口学统计描述粉尘螨过敏组（n=150）非粉尘螨过敏组（n=150）性别男性93(62.0%)93(62.0%)女性57(38.0%)57(38.0%)年龄例数150150均数±标准差13.7±11.020.1±15.5中位数9.113.3最小值－最大值4.0－52.14.0－55.9身高例数150150均数±标准差1.4±0.21.5±0.3中位数1.41.6最小值－最大值1.0－1.91.0－1.8体重例数150150均数±标准差38.5±18.843.8±19.8中位数32.048.0最小值－最大值15.0－87.015.0－85.0四、现病史情况表2.4现病史统计描述粉尘螨过敏组（n=150）非粉尘螨过敏组（n=150）耳鼻喉疾病是117(78.0%)97(64.7%)否33(22.0%)53(35.3%)呼吸系统疾病是88(58.7%)72(48.0%)否62(41.3%)78(52.0%)泌尿生殖系统疾病是2(1.3%)2(1.3%)否148(98.7%)148(98.7%)五、疾病诊断与症状（省略）六、sIgE和阿罗格点刺结果表2.5sIgE和阿罗格点刺统计描述阳性级别粉尘螨过敏组（n=150）非粉尘螨过敏组（n=150）粉尘螨特异性sIgE检测00150(100%)16(4.0%)221(14.0%)320(13.3%)427(18.0%)533(22.0%)643(28.7%)阿罗格点刺试验00150(100%)110(6.7%)220(13.3%)331(20.7%)489(59.3%)七、灵敏度和特异度分析粉尘螨过敏组和非粉尘螨过敏组的受试者共300人均使用了国产粉尘螨点刺诊断试剂进行皮肤点刺实验时，阳性对照都有风团或红晕出现，阴性对照都没有风团或红晕出现，因此粉尘螨过敏组和非粉尘螨过敏组的300名受试者都是可以作为试验评价的。表2.6灵敏度性和特异性评价点刺结果组别粉尘螨过敏组（n=150）非粉尘螨过敏组（n=150）阳性140(93.3%)6(4.0%)阴性10(6.7%)144(96.0%)阳性对照出现风团或红晕150(100%)150(100%)阳性对照出现丘疹150(100%)150(100%)阴性对照没有出现有风团或红晕150(100%)150(100%)灵敏度为93.33%，相应的总体灵敏度的95%可信区间为（88.08%，96.76%）特异度为96.00%，相应的总体特异度的95%可信区间为（91.50%，98.52%）以粉尘螨点刺所致丘疹面积与阳性对照所致丘疹面积比作为连续型诊断评价指标，选择不同的分割点计算相应的灵敏度和特异度作ROC曲线，得到下列结果：表2.7不同分割点的灵敏度和特异度分割点灵敏度特异度正确分类率正似然比LR+负似然比LR-(>=0)100.00%0.00%50.00%1(>=.02)93.33%68.00%80.67%2.91670.098(>=.032258)93.33%70.67%82.00%3.18180.0943(>=.038023)93.33%72.67%83.00%3.41460.0917(>=.047619)93.33%75.33%84.33%3.78380.0885(>=.060976)93.33%78.00%85.67%4.24240.0855(>=.068966)93.33%80.00%86.67%4.66670.0833(>=.080882)93.33%82.00%87.67%5.18520.0813(>=.105263)93.33%86.00%89.67%6.66670.0775(>=.113924)93.33%88.00%90.67%7.77780.0758(>=.166667)93.33%90.67%92.00%100.0735(>=.2)93.33%92.67%93.00%12.72730.0719(>=.217391)93.33%94.67%94.00%17.50.0704(>=.259259)93.33%96.67%95.00%280.069(>=.263889)91.33%96.67%94.00%27.40.0897(>=.271845)90.00%97.33%93.67%33.750.1027(>=.291667)87.33%97.33%92.33%32.750.1301(>=.346154)85.33%97.33%91.33%320.1507(>=.37931)83.33%97.33%90.33%31.250.1712(>=.466667)82.00%98.00%90.00%410.1837(>=.519802)78.67%98.00%88.33%39.33330.2177(>=.555556)77.33%98.67%88.00%58.00020.2297(>=.583333)75.33%98.67%87.00%56.50020.25(>=.625)73.33%98.67%86.00%55.00020.2703ROC曲线面积及其95%可信区间ROC-AsymptoticNormal--ObsAreaStd.Err.[95%Conf.Interval]--------------------------------------------------------3000.95080.01380.923710.97785说明即使调整分割点，平均灵敏度和平均特异度的估计值为95.08%，以95%可信度可以认为人群的平均灵敏度和平均特异度在92.371%～97.7785%，以粉尘螨点刺所致丘疹面积与阳性对照所致丘疹面积之比为诊断变量，当正确分类率为最大值时，其样本的最佳分割点为0.259259，即：粉尘螨点刺试剂与阳性对照所致丘疹面积之比大于25%诊断为粉尘过敏阳性，反之为粉尘过敏阴性，其灵敏度和特异度的样本估计值达到最大（分别93.33%和96.67%，这与本研究方案中设分割点为25%非常接近，并且均在相应的95%可信区间内，故可以认为两者差异无统计学意义，因此没有必要修正分割点。图2.2ROC曲线八、预测值分析当患有哮喘或变应性鼻炎的人群中的粉尘螨过敏率在0.4～0.9之间时，用该试剂进行检测的阳性预测值大于0.93，阴性预测值大于0.60。结果表明：该试剂具有较好的临床诊断价值。表2.8不同粉尘螨过敏比率时的阳性预期值和阴性预期值灵敏度特异度粉尘螨过敏率阳性预测值阴性预测值0.930.960.40.9393940.9536420.930.960.450.9500570.94370.930.960.50.9587630.9320390.930.960.550.9660060.9181720.930.960.60.9721250.9014080.930.960.650.9773650.8807340.930.960.70.98190.8545990.930.960.750.9858660.8205130.930.960.80.9893620.7741940.930.960.850.9924670.7076170.930.960.90.9952440.603774九、安全性分析没有明显的不良事件，故（省略）第六节本案例的讨论和评析该研究采用多中心的方法，对300例入选的患有支气管哮喘或/和变应性鼻炎的受试者使用浙江我武生物科技有限公司的“粉尘螨皮肤点刺诊断试剂”进行了皮肤点刺试验，结果显示“粉尘螨皮肤点刺诊断试剂”的灵敏度为93.3%，可信区间为88.08%～96.76%；特异度为96.