T-SHRH 024-2019 化妆品眼刺激性试验 体外重组3D角膜模型半数有效时间测试方法（ET50）

71.100.70C2682Y42

T/SHRH

024-2019________________________________________________________________________________________

ETEye

irritation

cosmetics-In

vitro

ET50

T/SHRH

024-2019前言…………… 21

32.

规范性引用文件………… 33.

术语、定义……………… 34.

试剂及仪器设备………… 35.

试验步骤………………… 46.

结果计算………………… 57.

质量控制………………… 5附录

A

6附录

B

7T/SHRH

024-2019 本标准按照

GB/T1.1-2009

给出规则起草。本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。公司、上海创元化妆品有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海绿瑞生物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海清轩生物科技有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、上海日用化学品行业协会。明、谢阿贵、廖峰、姜春鹏、赵奕竹、马骁、王飞飞、高宏旗、朱翠翠、李琼、金坚、陈亦华。T/SHRH

024-2019化妆品眼刺激性试验

体外重组

角膜模型半数有效时间测试方法（ET1 范围本标准规定了一种基于体外重组

角膜模型的眼刺激性测试方法。本标准适用于化妆品原料和成品的眼刺激性测试。本标准可作为眼刺激性动物试验的替代方法之一，可结合其他方法对眼刺激性进行综合分析。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法GB/T

化学品

体外皮肤腐蚀

人体皮肤模型试验方法化妆品安全技术规范3 术语、定义3.1

眼刺激性

眼前部直接接触待测物后，引起的眼及周围粘膜组织可逆性炎性损伤。3.2

viability测定细胞群体总活力的指标

[如细胞线粒体脱氢酶还原活性染料噻唑蓝（3-（4，5-二甲基噻唑），5-二苯基四氮唑溴盐，MTT]总数和活性细胞数量有关。3.3

，ET待测物在固定浓度下导致细胞存活率降低

50％所需的暴露时间。3.4

吸光度

optical

OD种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。4 试剂及仪器设备4.1

试剂和材料4.1.1

体外重组

角膜模型（BioOcullar®）。4.1.2

体外重组

角膜模型培养液（BioRecovery

培养液）。4.1.3

磷酸盐缓冲液

（PBS）。4.1.4

X-100

(0.3%，V/V)。4.1.5

（CAS

）。4.1.6

异丙醇。4.2

仪器和设备4.2.1

移液器：

活塞排代式移液器及相应吸头，20μL~200μL、100μL~1000μL

移液器及相应吸头。T/SHRH

024-20194.2.2

培养箱：37℃±1℃，（5±1），95%相对湿度。4.2.3 酶标仪：570nm。4.2.4 超净工作台。4.2.5 水平振荡仪。4.2.6 分析天平（精度

）。5 试验步骤5.1

准备工作5.1.1

待测样品与

MTT

用

PBS

缓冲液配置

的

MTT

母液，将

母液用

PBS

稀释至

的

MTT

工作液。取一个

24

24

24

孔中设置

2mL

的

MTT

80µL

或

待测样品加入

MTT

CO

培养箱（37±1℃、、95%相对湿度）中，孵育

3h。观察与对照孔是否有颜色差异，若MTT

溶液出现变蓝或紫色，说明待测样品与

反应，后续测试中需使用致死模型去掉非特异性吸光度值。若无颜色反应，则无需制备致死模型。5.1.2

制备致死模型将体外重组

24

孔板中，每孔加入

2mL

无菌去离子水，置于

4℃静置

24h

后，将角膜模型转移至℃冰箱保存，不超过

6

个月。5.1.3

模型准备体外重组

根据模型数量，按照

3

个模型

孔板，准备

6

孔板，并在每个孔中加入

BioRecovery

培养液。将体外重组

6

CO、孵育

。培养结束后，用无菌镊子将模型从

6

6

孔板放回至CO培养箱（37±1℃、

、相对湿度）中，孵育过夜（5.1.4

待测物预处理

37±1℃条件下预处理

用移液器可以吸取，则视为液体；若不能则视为固体。粉末状、颗粒状等待测物以固体对待。固体受试物需研磨至粉末方可进行给药。5.2

固体待测物用分析天平称取

，给药漏斗轻置于模型表面，使待测物均匀铺展。液体待测物吸取

80µL液给药。5.3

后孵育阳性对照（0.3%）给药后孵育时间设置为

，，，；洗去型化妆品待测物的给药后孵育时间设置为

，，，；驻留型化妆品待测物的给药后孵育时间设置为：0h，6h，16h，24h；给药后孵育时间也可根据待测物特性进行微调。5.4

模型孵育培养结束后，开始清洗程序。用无菌

PBS

溶液重复清洗模型表面

次，去除残留的待T/SHRH

024-2019测物。每个模型的清洗总时间需控制在

。5.5

MTT

反应根据模型总数量准备

24

孔板，并向每孔加入

的

MTT

工作液。将模型转移至

24

孔板中，置于

培养箱中（℃、

、95%相对湿度），孵育

。MTT

液器吸弃

溶液，加入

300μLPBS

溶液，清洗模型外表面，重复此清洗过程

3

次。5.6

异丙醇浸提将模型外表面用无菌棉签擦干，转移到新的

24

孔板中，在模型内加入

2mL

异丙醇。用封口膜密封

24

孔板，于

4℃静置过夜或在水平震荡器上常温震摇

。5.7

OD

值测定从每孔中吸取

2

份

200μL

96

白对照，酶标仪

570nm

波长读取吸光度（OD）值。6 结果计算6.1

空白对照：读取

3

个空白对照

OD

值，其平均值作为空白对照

OD

值。6.2

阳性对照：阳性对照组各时间点组织活力=（阳性对照组各时间点

OD

值-空白对照

OD

/（阳性对照组

OD

值-空白对照

OD

。6.3

待测样品：待测物组各时间点组织活力=（待测物组各时间点

OD

值-空白对照

OD

值）/（阳性对照组

OD

值-空白对照

OD

值）。6.4

值计算以各组组织活力邻近

50%左右的两个时间点为横坐标，其对应组织活力为纵坐标，绘制折线图，计算线性回归方程。根据公式，计算组织活力为

时，对应的时间，即为该组的

7

质量控制7.1

基本原则：测试中设置的对照检测应符合以下情况，如出现非下述标准，则视为质控不合格。7.2

阳性对照：ET值反映体外重组

角膜模型的屏障功能,其合格质控范围为

；

OD值反映体外重组

角膜模型的活性，其合格质控范围为

0.8~2.5。7.3

待测物：每个待测物同一暴露时间下

3

个重复模型的相对活性标准偏差小于或等于

。T/SHRH

024-2019附录

A（资料性附录）图

A.1

体外重组

角膜模型组织学结构图（）T/SHRH

024-2019附录

B（资料性附录）溶液的配制1.

X-100（0.3%，）溶液的配制使用排代式移液器吸取

3

至

99