岗比亚藻分类与实验生态学研究

岗比亚藻分类与实验生态学研究雪卡毒素(Ciguatoxins,CTX)是一类富集于珊瑚礁鱼体内的聚醚类化合物,由13-14个环组成。人类食用染有雪卡毒素的珊瑚鱼可引发雪卡毒素中毒(Ciguaterafishpoisoning,CFP)。该毒素毒性强,是已知的危害性最严重的海洋生物神经毒素之一,全球每年至少25,000人因误食染毒的海产品而造成雪卡毒素中毒。CFP中毒主要流行于35°N-37°S的加勒比海、太平洋、大西洋和印度洋海域。随着全球气候变暖,产毒藻分布范围逐渐扩大及珊瑚鱼贸易和旅游事业发展,CFP危害呈愈加严重趋势。雪卡毒素前体为岗比毒素(gambiertoxin),由小型底栖甲藻一岗比亚藻(Gambierdiscusspp.)产生。岗比亚藻是单细胞藻类,主营底栖附生,分布于热带、亚热带及温带水域。与开放水域能形成赤潮的甲藻不同,它们一般不形成水面藻华,而是附着于大型藻或者硬质死亡珊瑚表面。1977年,日本与法国联合在太平洋岗比岛(GambierIslands)首次分离到该藻,证实了雪卡毒素产毒藻的存在。岗比亚藻主要产生两类毒素：一类为脂溶性岗比毒素,经食物链逐级传递、积累与代谢后,转化成极性和毒性更强的雪卡毒素；另一类为水溶性的刺尾鱼毒素(maitotoxin,MTX)、岗比酸(gambiericacid)和gambierol,其中刺尾鱼毒素是目前发现的毒性最大的非蛋白质毒素。因岗比亚藻产生的水溶性毒素具有水溶性、低口服毒性的特点,一般认为它们不在鱼体内累积。此外底栖甲藻Prorocentrum、Ostreopsis、Amphidinium、Coolia与岗比亚藻共栖于同一底质,鱼类摄食含有岗比亚藻的大型藻时极可能同时摄入上述有毒底栖甲藻,这些甲藻能产生多种毒素如okadaicacid、palytoxin及cooliatoxin,结合雪卡毒素中毒症状的复杂性,它们被视作雪卡毒素的潜在产毒藻。与全球有毒有害藻华发展趋势一致,受环境因素和人类活动影响,雪卡毒素中毒事件亦在扩大,因此雪卡毒素产毒藻是目前国际上底栖微藻领域的研究热点之一。自1977年岗比亚藻被发现后,该藻的分类学研究主要依据超微结构和形态学特征,即细胞大小与形态、甲板大小、形状及排列方式。岗比亚藻的细胞外形有球形和背腹扁平两种类型,目前报道的种类多属于后者。传统分类方法由于分辨率有限,对背腹扁平种类的正确识别存在较大困难,易发生种类误定,致使该藻的生理学、生态学、毒理学等诸多研究中,G.Toxicus可能包含数个种(species),对株(strain)的阐述则可能反映了种水平上的差异。2009年,通过传统分类方法与分子生物学(LSUrDNA,SSUrDNA基因等)方法相结合,成功实现了对岗比亚藻种水平的正确鉴定。学者们建议在此基础上开展种类修订工作,对岗比亚藻进行二次分类研究并对之前结果修订补充。本论文即在此背景下展开,包括以下两部分内容。第一部分,首次研究了太平洋中部岛国基里巴斯Marakei岛的雪卡毒素产毒藻岗比亚藻及潜在产毒藻Prorocentrum、Ostreopsis、Amphidinium与Coolia的组成、种群密度和分布模式。基里巴斯是世界上雪卡毒素高发国家,Marakei岛尤为严重,该岛较基里巴斯其它岛屿染毒鱼数据翔实。本论文结合分子生物学与形态学方法,首次完成了Marakei岛海域岗比亚藻的种水平鉴定；并通过收集扩大培养的岗比亚藻样品,运用小鼠母神经瘤分析法(Mouseneuroblastomaassay)第一次对该海区藻细胞毒性进行了测定。研究填补了基里巴斯岗比亚藻种分类与毒性信息空白,将对Marakei岛染毒鱼类的分布特征提供理论依据。第二部分,研究了分类明确的岗比亚藻,实验室条件下对温度、盐度和光照因子的生长响应。首次阐述了岗比亚藻对环境因素响应的种内差异；第一次使用基因型岗比亚藻Gambierdiscussp.ribotype1、Gambierdiscussp.type42及Gambierdiscussp.type5进行生长特性研究；并首次将实验温度升至>34℃,盐度区间扩大至10-60,使之符合真实海域环境；另使用的17藻株均为首次用于生长研究。它一方面是对本文第一部分研究内容的深入,从实验室角度揭示岗比亚藻生长的环境因子需求,推测Marakei水域是否适合雪卡毒素产毒藻岗比亚藻的长期繁生,从而为当地雪卡毒素爆发提供依据。另一方面是对现有研究的深入,2009年之前,岗比亚藻生长特性相关研究因受分类方法限制,无法获取种间水平信息,因而对不同文献研究结果的差异判定困难。2009年之后,尽管种水平信息明确的研究见诸报道,但该类研究对象仅为岗比亚藻种内的某一株系,种内差异仍无从获知,且种间差异能否由某一藻株代表仍有待进一步开展工作。这部分研究中,除G.carpenteri分离自FloridaKeys,其余16株岗比亚藻来自基里巴斯Marakei岛与美国维京群岛下属的St.Thomas岛。共计8种(5岗比亚藻种,3基因型种)17株。研究表明Marakei岛含有雪卡毒素产毒藻属Gambierdiscus与潜在产毒藻属Prorocentrum、Ostreopsis、Amphidinium与Coolia。除Site2浅水体(2-3m),Ostreopsis所占丰度最高,达到351cellsg-1Halimedasp.外,其余站位Gambierdiscus所占比例最高,密度为0-175cellsg-1Halimedasp.。岗比亚藻在该岛西部分布呈现两个显著特征：(1)浅水体(2-3m)站位较深水体(10-15m)站位岗比亚藻丰度高；(2)Site1与Site2岗比亚藻平均密度比Site3与Site4高,前者为后者的19-54倍。第一个特征推测由不同水层光照强度差异引起,第二个特征与之前发表的有毒鱼分布模式相吻合,即靠近Site1与Site2海域鱼类毒性较Site3与Site4附近海域鱼类毒性高。与其它海域报道的结果比较,本研究中的岗比亚藻密度属低丰度。通过对Marakei岛38株岗比亚藻DNA序列分析,发现3个明确命名种：G.belizeanus、G.carpenteri和G.pacificus,3个全球首次记录基因种：Gambierdiscussp.type4、Gambierdiscussp.type5及Gambierdiscussp.type6,G.belizeanus系在密克罗尼西亚群岛(Micronesia)首次发现,该种在大西洋广为分布。分子进化树结果显示Gambierdiscussp.type4可能与目前仅在大西洋发现的Gambierdiscussp.ribotype1属于同一基因种。对实验室实现成功培养的三个种Gambierdiscussp.type4(4株)、Gambierdiscussp.type5(1株)与G.pacificus(1株)进行了形态学与毒性分析。扫描电子显微镜显示它们均为背腹扁平型岗比亚藻,具典型鱼钩状顶孔板(apicalporeplate,Po)开口,甲板式Po,3’,7”,5’’’,1p,2’’’’’,顶板(apicalplate)中,2’最大。Gambierdiscussp.type4与Gambierdiscussp.type5、G.pacificus比较而言,前者细胞表层光滑,细胞尺寸大于后者,前者顶板(apicalplate)2’呈斧状,后者呈矩形,另前者后间插板(posteriorintercalaryplate)lp较后者宽阔。毒性检测发现岗比亚藻均产生类似雪卡毒素(CTXs-like)。与形态学差异呼应,Gambierdiscussp.type4与Gambierdiscussp.type5,G.pacificus毒性存在差异。前者毒性大小为2.6-6.0(均值：4.3±1.4,n=4),后者为0.010(n=1)、0.011(n=1)fgP-CTX-1eqcell-1,两者之间差异高达两个数量级。Marakei岛所测岗比亚藻属于低-中毒性种。岗比亚藻(17株)G.belizeanus,G.caribaeus、G.carolinianus、G.carpenteri、G.pacificus、Gambierdiscussp.ribotype1、Gambierdiscussp.type4及Gambierdiscussp.type5对温度、盐度和光照的单因子响应实验表明,在温度16-38℃,盐度10-60,光照55-400nmolphotons·m-2·s-1范围内,所有岗比亚藻株生长均经历对数生长期、稳定期、衰亡期三个阶段,但各藻株的生长期不尽相同。岗比亚藻生长率为0-0.48divisionsday-1,生长率由藻株而非藻种决定。岗比亚藻对温度16-38℃和盐度10-60的响应近似高斯曲线,即在温度与盐度中值变化范围内,岗比亚藻生长良好,接近其阈值时,生长明显受抑制继而死亡。总的来说,该藻属不能在温度≤17.5℃或≥32.5℃,盐度≤20或≥50条件下存活。岗比亚藻在光照55-400μmolphotons·m-2·s-1生长良好,高光照110-400pmolphotons·m-2·s-1下生长率较低光照55μmolphotons·m-2·s-1高。总体而言,生长率的变异系数在两端实验温度、盐度和光照条件下高于中间范围变异系数的值,意味着藻株对不利环境条件的耐受能力存在明显差异。岗比亚藻生长率种内差异(a<0.05)在最佳生长环境下达到最大,表明环境条件适宜时,某些岗比亚藻种在群落中将占据主导地位,从而更多参与雪卡毒素形成。生长率与温度、盐度多项式回归结果显示17株岗比亚藻最佳生长温度为23.8-29.2℃、最低耐受温度为15.9-20.1℃、最高耐受温度为29.8-35.4℃,最佳生长盐度为30.1-38.5、最低耐受盐度为10.4-27.2、最高耐受盐度为47.6-57.0。这些结果表明岗比亚藻对高温、高低盐的耐受超过以往实验室研究,当其它环境因子适宜时,对低温的耐受能使该藻扩张至35°N38°N与42°S-45°S,且正常海域盐度满足岗比亚藻最佳生长需求。在全球变暖环境下,岗比亚藻对不利环境的耐受能力从生理学角度预示了岗比亚藻(雪卡毒素)扩张的可能。另外,岗比亚藻对温度、盐度特征响应值由藻株决定,种内差异明显,单株不能代表种水平特征。但来自G.belizeanus、G.caribaeus、G.carpenteri与G.pacificus的藻株较其它种的藻株更有可能适应不利温度与盐度生长条件,这与