一种中药生发液的安全性评价和药效学研究

摘要：现代社会，精神压力和不良生活习惯等因素使得脱发成为越来越多人的困扰。脱发不仅会破坏个人外在形象，也会对患者的心理造成负面影响。开发外用中药生发产品具有广阔的市场前景。而在各种疗法和产品正式上市前，安全性评价和药效学评价必不可少。本项目是对一种新型中药生发液进行家兔皮肤刺激性实验、急性眼刺激试验和小鼠药效学试验，建立KM小鼠脱毛模型，脱毛后涂抹生发液，观察毛发生长情况，处死后取皮片来统计新生毛发长度和重量，并且对小鼠皮肤组织和毛囊观察，判断生发液对于小鼠毛发生长的促进作用，作为生发液药效学评价的依据。该款生发液对家兔皮肤和眼睛均无严重刺激且能够促进小鼠毛发生长。英文摘要：Inmodernsociety,hairlosshasbecomeaproblemformoreandmorepeopleduetomentalstressandbadlivinghabits.Hairlosscannotonlydamageaperson'sappearance,butalsohaveanegativepsychologicalimpactonthesufferer.ThedevelopmentofexternalTCMhairproductshasbroadmarketprospects.Safetyevaluationandpharmacodynamicevaluationareessentialbeforevarioustherapiesandproductsareofficiallymarketed.Inthisproject,rabbitskinirritationtest,acuteeyeirritationtestandmousepharmacodynamicstestwerecarriedoutonanewTCMhairgrowthsolution,andKMmousehairremovalmodelwasestablished.Afterhairremoval,hairgrowthwasobservedbyapplyingthehairgrowthsolution.Afterdeath,skinslicesweretakentocalculatethelengthandweightofnewhair,andskintissueandhairfolliclesofmicewereobserved.Toevaluatetheeffectofgerminalfluidonthegrowthofmousehair,andtoevaluatethepharmacodynamicsofgerminalfluid.Thishairgrowthliquidhasnoseriousirritationtorabbitskinandeyesandcanpromotehairgrowthinmice.关键词：雄激素脱发；家兔皮肤刺激试验；家兔眼刺激试验；小鼠脱发模型；生发液；安全性评价Androgenicalopecia；rabbitskinstimulationtest；rabbiteyestimulationtest；mousealopeciamodel；hairgrowthfluid；safetyevaluation第一章前言1.1雄激素脱发主要治疗方法现代社会，精神压力和不良生活习惯等因素使得脱发成为越来越多人的困扰。脱发不仅会破坏个人外在形象，也会对患者的心理造成负面影响。雄激素类脱发（AGA）是一种最常见的脱发类型，又名脂溢性脱发，是一种发生于青春期和青春期后的毛发减少性疾病，是最常见的进行性脱发原因之一[[].吴瑞英.复方斯亚旦生发酊治疗雄激素性秃发的临床和实验研究[D].北京中医药大学,2021.]。其主要的病理表现为毛囊生长期缩短导致毛囊微小化，使较粗的、具有色素的终毛逐渐被细软的、色素脱失的毳毛取代。在AGA患者中，随着毛囊的生长期逐渐缩短，受累毛囊处在退行期／休止期的毛囊将会成比例增加导致毛干的直径逐渐变小，毛干的颜色变浅发展为毳毛。根据流行病学的研究[[[].吴瑞英.复方斯亚旦生发酊治疗雄激素性秃发的临床和实验研究[D].北京中医药大学,2021.[].WangTL,ZhouC,ShenYW,etal.PrevalenceofandrogeneticalopeciainChina:acommunity-basedstudyinsixcities[J].

BrJDermatol.2010;162(4):843-847.目前AGA治疗方法包括药物治疗、低能量激光治疗（LLLT）、微针治疗、富血小板血浆治疗（PRP）等[[]孙建林,吕新翔.雄激素性脱发的发病机制与治疗进展[J].内蒙古医科大学学报,2020,42(01):106-108+112.]。目前FDA批准治疗AGA[]孙建林,吕新翔.雄激素性脱发的发病机制与治疗进展[J].内蒙古医科大学学报,2020,42(01):106-108+112.米诺地尔原本作为钾离子通道开放药治疗高血压等疾病，目前治疗AGA的作用机制尚不明确，可能与刺激毛囊上皮细胞的增殖和分化，从而延长毛发生长期；促进血管内皮细胞生长因子及其受体的表达，从而促进血管生成和毛发生长；作为钾离子通道开放药，阻止细胞内钙离子的聚集，从而阻止表皮生长因子抑制头发的生长等有关。但外用米诺地尔会引起接触性皮炎，并可引起全身多毛症，并且米诺地尔的起效时间较长，一般为３个月，停药还可能引起严重的不良反应[[]唐宇,张旭冉,谢君等.雄激素性脱发的非手术治疗进展[J].武汉大学学报(医学版),2023,44(01):45-49.DOI:10.14188/j.1671-8852.2022.0522.]。男性推荐使用5%浓度，女性推荐2%浓度。用法为2次/d[]唐宇,张旭冉,谢君等.雄激素性脱发的非手术治疗进展[J].武汉大学学报(医学版),2023,44(01):45-49.DOI:10.14188/j.1671-8852.2022.0522.MahidolUniversity[[]Varothai,S.,Bergfeld,W.F.AndrogeneticAlopecia:AnEvidence-BasedTreatmentUpdate.

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15[]Varothai,S.,Bergfeld,W.F.AndrogeneticAlopecia:AnEvidence-BasedTreatmentUpdate.

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15,217–230(2014).非那雄胺是Ⅱ型5-α还原酶选择性抑制剂，抑制二氢睾酮合成，从而抑制脱发。但也易引起男性勃起功能障碍、性欲下降、精子一过性减少及乳房发育等不良反应[4]。PRP[[]李琳琳,程飚.富血小板血浆在雄激素性脱发治疗中的临床研究进展[J].中国美容整形外科杂志,2020,31(10):612-614.]中含有多种生长因子、细胞因子，具有促进细胞增殖、分化、基质合成、组织再生与修复等作用，能够使头皮的上皮组织增厚，胶原纤维和成纤维细胞增生，毛囊周围血管增多[[][]李琳琳,程飚.富血小板血浆在雄激素性脱发治疗中的临床研究进展[J].中国美容整形外科杂志,2020,31(10):612-614.[]AnituaE,PinoA,MartinezN,OriveG,BerridiD.TheEffectofPlasmaRichinGrowthFactorsonPatternHairLoss:APilotStudy.DermatolSurg.2017May;43(5):658-670.LLLT[[][]高淑萍,李刚.雄激素性脱发的治微针能够对皮肤造成微小损伤，刺激生长因子产生，促进胶原蛋白和弹性蛋白生成，可以与其他治疗方法联用治疗AGA[[][]陈礼刻,黄熙.微针在脱发疾病治疗中的应用进展[J].中国美容医学,2022,31(12):196-199.目前各种治疗方法各有不足：化学药物不良反应多、生物药成本较高，各种方法联用可以取得更好的效果。因此，开发更加安全高效的AGA治疗药物成为当今研究的热点。中医药治疗AGA已有悠久的历史，中药治疗AGA具有多靶点、多成分协同作用的优势，具体的作用机制尚不明确，可能具有拮抗雄激素，抑制5a-还原酶，改善微循环和调节微量元素的作用，何首乌、女贞子、侧柏叶等都是常见的治疗药材，可以采用内服、外用、针灸等多种治疗方式相结合来治疗[[]ZhangB,ZhangRW,YinXQ,etal.InhibitoryactivitiesofsometraditionalChineseherbsagainsttestosterone5α-reductaseandeffectsofCacumenplatycladionhairre-growthintestosterone-treatedmice.

JEthnopharmacol.2016;177:1-9.]。中医药[[]ZhangB,ZhangRW,YinXQ,etal.InhibitoryactivitiesofsometraditionalChineseherbsagainsttestosterone5α-reductaseandeffectsofCacumenplatycladionhairre-growthintestosterone-treatedmice.

JEthnopharmacol.2016;177:1-9.[]李思远,武忠.中医药治疗脂溢性脱发的临床研究进展[J].中国中医药科技,2022,29(06):1135-1138.1.2化妆品安全性评价本项目是对一种新型中药生发液进行家兔皮肤刺激性实验、急性眼刺激试验和小鼠药效学试验，评价其安全性和有效性，为产品的临床试验和上市提供依据。随着经济水平提高，人们越来越关注个人形象，化妆品市场也日益扩大，关于化妆品的安全问题也更加引起人们的注意。为了尽可能避免化妆品安全性事故的发生，我们需要提前进行化妆品安全性检测。根据《化妆品安全技术规范》2022版中所述，化妆品安全评价是指采用经济合作和发展组织推荐的化妆品物质毒理学试验原则和方法，来对化妆品的安全性进行评估的一类方法。根据化妆品所用原料的风险评估资料，结合产品使用方式、使用量、残留等暴露水平，对化妆品产品进行风险评估，以确保产品安全性。根据毒理学检测项目的原则，根据化妆品中所含的原料，一般会进行以下实验：急性经口和经皮实验、皮肤变态实验、皮肤和眼刺激实验、皮肤光毒性实验、致突变实验、亚慢性经口和经皮毒性实验、致畸实验等，还要根据化妆品中所含有的成分，进行其他必要的实验。若所生产的化妆品中所含的原料与已经用于其他化妆品中的化学结构相似，这样可以减少某些实验。1.3小鼠脱毛模型建立常见的脱毛方法[[][]九红.一种新型生发液的安全性及生发作用研究[D].西南医科大学,2022.第二章研究内容2.1家兔急性眼刺激试验家兔眼球大，几乎成圆形，便于进行操作和观察，所以我们选用家兔进行急性眼刺激试验。家兔眼刺激试验需要了解家兔结膜、角膜、虹膜的结构。虹膜是白色巩膜和瞳孔之间的圆盘状膜，呈中空环型。角膜位于虹膜、瞳孔和前房的前方，是透明薄膜。结膜位于眼睑内，并且覆盖在眼白上。四只家兔左右两只眼睛自身对照，左眼滴入生发液产品，右眼不作任何处理，每隔一段时间观察其结膜、角膜、巩膜现象及是否出现水肿，从而判断生发液对于家兔单次眼刺激的刺激性，作为生发液安全性评价的依据。2.1产品眼刺激性反应分级类型程度积分可逆眼损伤微刺激性动物的角膜、虹膜积分=0；结膜充血和/或结膜水肿积分≤2，且积分在＜7天内降至0轻刺激性动物的角膜、虹膜、结膜积分在≤7天降至0刺激性动物的角膜、虹膜、结膜积分在8—21天内降至0不可逆眼损伤腐蚀性动物的角膜、虹膜和/或结膜积分在第21天时＞02/3动物的眼刺激反应积分：角膜浑浊≥3和/或虹膜=22.2眼损害的评分标准眼损害积分角膜无溃疡形成或混浊0散在或弥漫性混浊，虹膜清晰可见1半透明区易分辨，虹膜模糊不清2出现灰白色半透明区，虹膜细节不清，瞳孔大小勉强可见3角膜混浊，虹膜无法辨认4虹膜正常0皱褶明显加深，充血、肿胀、角膜周围有中度充血，瞳孔对光仍有反应1出血、肉眼可见破坏，对光无反应（或出现其中之一反应）2结膜血管正常0血管充血呈鲜红色1血管充血呈深红色，血管不易分辨2弥漫性充血呈紫红色3水肿无0轻微水肿（包括瞬膜）1明显水肿，伴有部分眼睑外翻2水肿至眼睑近半闭合3水肿至眼睑大半闭合42.2家兔皮肤刺激试验白色家兔皮肤构造与人类比较相似，且大多数情况下比人的皮肤对于腐蚀性和刺激性的药品要敏感，皮肤面积大，所以选用白色家兔进行皮肤刺激性试验。四只家兔左右两侧皮肤局部脱毛，左侧多次涂抹生发液，右侧不做任何处理自身对照，观察皮肤是否出现红斑、水肿等现象，判断生发液对于家兔多次皮肤刺激的刺激性，作为生发液安全性评价的依据。2.3皮肤刺激强度评分积分均值强度0—＜0.5无刺激性0.5—＜2.0轻刺激性2.0—＜6.0中刺激性6.0—8.0重刺激性2.4皮肤刺激反应评分皮肤反应积分红斑和焦痂生成无红斑0轻微红斑1明显红斑2中度-重度红斑3严重红斑至轻微焦痂生成4水肿形成无水肿0轻微水肿（勉强可见）1轻度水肿（皮肤隆起轮廓清楚）2中度水肿（皮肤隆起约1mm）3重度水肿（皮肤隆起超过1mm，范围扩大）4最高积分82.3小鼠生发液药效学实验AGA的关键病理生理特征[[][]李琳琳.雄激素脱发模型小鼠的建立及其初步探讨[D].南方医科大学,2021.KM小鼠用药量较少，容易饲养，对环境的适应力和抗病力都较强，常用于药理研究，所以我们选用KM小鼠进行药效学试验，而脱发多发于男性，所以我们选用雄性KM小鼠。选用15只雄性小鼠（脱发常见于男性），随机分为五组：模型组、阳性组（米诺地尔）、生发液组、生发液水提组、生发液醇提组。脱毛后涂抹生发液，观察毛发生长情况，处死后取皮片来统计新生毛发长度和重量，并且对小鼠皮肤组织和毛囊观察，判断生发液对于小鼠毛发生长的促进作用，作为生发液药效学评价的依据。2.5新生毛发评分表新生毛发情况积分无毛生长0浅毛长满脱毛区1新生毛长度及密度约为未脱毛区的一半2新生毛长与未脱毛区无差别3第三章结果与讨论3.1家兔急性眼刺激实验结果结果见表3.1和3.2。生发液对家兔眼球进行单次给药，在给药后1h、24h、48h、72h、5d、7d进行眼剌激性检查,按照表2.1和2.2进行评分。家兔眼角膜、虹膜和结膜的剌激分值之和为0，提示生发液无严重眼剌激性。3.1单次眼刺激评分组别动物数（只）观察时间虹膜积分角膜积分结膜积分药物组41h11124h00148h00072h0005d0007d0003.2单次眼刺激强度组别1h24h48h72h5d7d药物组微刺激微刺激无刺激无刺激无刺激无刺激3.2家兔皮肤刺激性实验结果结果见表3.3。实验期间家兔行为活动、进食、外观体征都处于正常，无家兔死亡。在家兔涂抹药物部位的皮肤无瘙痒、出血点、皮肤粗糙等情况。在涂生发液之后的1、6h有勉强可见的轻微红斑，无水肿，总积分为0.25。而在第24、48h都没有无红斑和水肿等刺激现象，各个时间点总积分都为0，提示生发液对皮肤无刺激性。3.3家兔皮肤刺激反应评分结果时间（h）动物数（只）红斑积分水肿积分总积分14100.2564100.251240002440004840003.3小鼠药效学试验结果第四章论文总结4.1家兔安全性评价依据《化妆品安全技术规范（2021版）》，进行家兔皮肤刺激试验和急性眼刺激试验，证明新型生发液对家兔皮肤无刺激性，对眼部无严重刺激性，表明新型生发液安全性较高。虽然白色家兔皮肤构造与人类比较相似，且大多数情况下比人的皮肤对于腐蚀性和刺激性的药品要敏感，但是还是不能直接把实验结果外推到人。后续可以选用其他品种的动物进行安全性评价以增加实验结果的可靠性。家兔皮肤刺激试验的缺陷：在试验过程中，有一只家兔由于多次脱毛导致皮肤受损无法继续试验。由于生发液产品的特殊性，导致家兔毛发生长速度加快，对试验本身造成影响，需要脱毛次数较其它产品增多。而在使用脱毛膏给家兔脱毛的过程中，脱毛膏本身和刮板会给家兔皮肤造成化学和物理损伤，影响皮肤刺激评价，导致试验结果不够准确。面对试验过程中家兔毛发生长可以仅使用动物脱毛器进行物理剃毛。同时后续也可以重复利用家兔进行药效学评价。可以预先扩大脱毛面积，脱毛后选择脱毛效果较好的部分正式进行试验。家兔急性眼刺激试验的缺陷：家兔眼部照片拍摄最好保证在相同时间、相同位置、使用相同设备，避免因为外部条件导致的差异性。4.2小鼠药效学试验小鼠药效学试验选用KM小鼠的毛发生长个体差异性较大，对试验结果造成影响。下一步试验决定选用C57BL/6小鼠重复药效学试验[[]刘学.生发、乌发中草药复方的筛选及其药效学研究[D].中国医药工业研究总院,2020.DOI:10.27886/ki.gyygy.2020.000016.]，在C57BL/6小鼠中，毛发生长周期几乎是全身毛发同步的，皮肤[]刘学.生发、乌发中草药复方的筛选及其药效学研究[D].中国医药工业研究总院,2020.DOI:10.27886/ki.gyygy.2020.000016.另外本试验每组小鼠数量为3只，数量较少，可以适当增加实验动物数量，增加实验说服力，避免偶然性。本实验验证了新型生发液对KM小鼠毛发生长的影响，但未进行相关作用机制研究，后期实验可以进一步构建AGA小鼠脱发模型、毛囊体外培养模型、细胞模型，以探究作用机制。脂溢性脱发的动物模型在探究发病机制、筛选有效药物、选择合适治疗方法中发挥重要作用。新西兰家兔、绵羊、豚鼠、昆明小鼠、SD大鼠、B6CBAF1/J小鼠等都可用作为脂溢性脱发动物模型。其中，B6CBAF1/J小鼠在性成熟期以各种途径补充雄激素，可导致背部毛发脱落。但该小鼠可及性较低，使用受到限制。目前，应用最多的是C57BL/6小鼠建立皮下注射丙酸睾酮的脱发模型[15]。但由于脂溢性脱发发病机制未完全明确，与多种因素有关，所以动物模型只能一定程度上模拟疾病的进程，存在局限性。而且脂溢性脱发动物模型选择、脱毛剂选择、造模时间差别大，如脂溢性脱发小鼠模型实验中，丙酸睾酮注射时间不等，小鼠病变可逐渐恢复正常，致使造模效率低、风险大等。通过AGA脱发模型和HaCat细胞增殖试验[13]，通过小鼠的新生毛发生长积分、毛长和毛重、病理组织、毛囊数量，以及对小鼠血清中的睾酮（T）、肝细胞生长因子（HGF）和雌二醇（E2）等指标，探讨生发液对脱发小鼠的生发作用机制。利用CCK-8法检测人永生化表皮细胞（HaCat细胞）的增殖，在给药24h、48、72h时，测定在450nm处的OD值，计算HaCat细胞的存活率，评价新型生发液对AGA小鼠毛发生长的促进作用。第五章实验部分5.1家兔急性眼刺激试验（1）材料与仪器设备新型生发液、兔台、移液枪、智能手机、白色家兔4只（成年、健康、皮肤无损伤，雌雄各半，雌性动物应是未孕和未曾产仔的，体重在2.0-3.0kg，单笼饲养，提前在动物房适应3d时间）（2）实验操作a．用记号笔在家兔耳侧编号。b.将家兔置于兔盒之中。c.观察家兔眼睛结膜、虹膜、角膜是否正常以及是否出现水肿。d.用移液枪将0.1ml的新型生发液分两次滴入家兔右眼结膜囊中，第一次待药液吸收后即闭合眼睑，第二次全部药液注入后闭合眼睑30s。e.分别在滴入生发液1h、24h、48、72h、5d、7d后，在相同光照条件下，观察家兔结膜、虹膜、角膜及水肿情况，拍照并根据表2.1和2.2计算积分。5.2家兔皮肤刺激性试验（1）材料与仪器设备新型生发液、薇婷脱毛膏、生理盐水、动物剃毛器、剪刀、棉球、纱布、大烧杯、镊子、记号笔、签字笔、尺子、100ul移液枪、手机、白色家兔4只（雌雄各半，体重在2.0-3.0kg）（2）实验操作A.适应性饲养3天，实验前24h进行家兔脱毛（脱毛膏脱毛）：a.剃毛:去除背毛（家兔背部两侧各6×6cm）一人固定动物后,另一人用动物脱毛机脱去被毛。剃毛时需绷紧局部皮肤，注意不要剃破皮肤。同时为了避免被毛到处飞扬，使用大烧杯装水放置兔毛。b.脱毛（5-10min）去除局部被毛后，取适量脱毛膏置于处理过的家兔表面，用附带的刮板抹匀，4min后用棉球蘸取生理盐水除去脱毛膏，观察家兔表皮是否正常，放回兔笼，单笼饲养。B.皮肤刺激实验:a.用记号笔在家兔脱毛后的裸露皮肤上标注编号，采用自身对照法（生发液统一涂抹于家兔右边背部，左边作为对照），用移液枪吸取0.5ml生发液，使用提前用生发液润湿过的棉签均匀涂抹在家兔右侧，每天1次，连续涂抹7天，每次给药前都需要观察家兔脱毛部分的情况是否出现水肿和红斑这些刺激现象，并且用棉球蘸取生理盐水除去剩余生发液。b.第7天停止用药。在停药后的1、6、12、24、48h观察家兔皮肤的刺激反应，然后根据评分标准打分。观察涂抹部位皮肤反应，按照表2.3进行评分。按照公式：刺激性反应平均值=（红肿积分+水肿积分）/受试动物数，计算观察期限内每一只家兔刺激积分均值。最后根据表2.4判定皮肤刺激强度。5.3小鼠生发液药效学试验（1）材料与仪器设备KM小鼠15只（雄性，体重23-27g），松香石蜡，电磁炉，烧杯，尺子，棉签，针管，水合氯醛，米诺地尔，生发液（原液、醇提、水提），电子天平（2）实验操作A.脱毛a.适应性饲养3天后，小鼠称重，根据体重腹腔注射水合氯醛麻醉b.待小鼠麻醉成功后，先用动物剃毛器将小鼠背部后半部分的毛发脱除。再将松香和石蜡按照1:1的比例置于烧杯中，在电磁炉上加热融化为浅褐色液体，放凉至稍高于小鼠皮温后均匀涂抹至用剃毛器处理过的部分，注意涂抹的时候一定要保证松香石蜡为液体没有固化，待冷却变硬后，撕去凝固的松香石蜡，将小鼠后半部分的毛发去除干净。B.给药分组小鼠脱毛24h后，将15只小鼠随机分成5组（信号笔尾标记）：模型组（不做任何处理）、阳性组（米诺地尔）、生发液1组（新型生发液产品）、生发液2组（水提生发液）、生发液3组（醇提生发液）除模型组小鼠外，各组小鼠每天给药2次，每次0.2ml。通过注射器给药，然后用提前用相应药物润湿的棉签涂抹均匀。给药第2天，阳性组一只小鼠死亡，从模型组中随机选取一只小鼠作为阳性组。C.对脱毛小鼠的生长状况评价从小鼠背部涂药第3天开始，每天观察并记录小鼠背部脱毛区域皮肤状况，每天在同一光源下使用同一设备拍照，观察毛发生长情况并且根据表2.5对小鼠新生毛发进行评分。每组小鼠的最终评分为组内小鼠评分的平均值。D.小鼠毛发长度及重量计算待小鼠脱毛区域毛发恢复至原本生长状况，脱颈处死小鼠。在每只小鼠背部脱毛区域随机拔取10根毛发，取平均值作为各小鼠新生毛发长度，再计算各组小鼠毛长均值；每只小鼠背部脱毛区域选取相同位置使用20mm打孔器取圆形皮片，将皮片上所用的毛发用手术刀刮下，进行称重，计算各组小鼠毛重均值。E.对小鼠皮肤组织及毛囊的观察将小鼠皮肤浸泡于组织固定液中固定，石蜡包埋，取横纵切片，HE染色，在显微镜下（×100、×400）观察毛囊纵切面和横切面情况；另外对毛囊数量、终毛及毳毛数量统计计数，在显微镜（×200）下随机选取3个视野，计算终毛/毳毛比例。参考文献[1]吴瑞英.复方斯亚旦生发酊治疗雄激素性秃发的临床和实验研究[D].北京中医药大学,2021.[2]WangTL,ZhouC,ShenYW,etal.PrevalenceofandrogeneticalopeciainChina:ac