T∕CACM 1027.104-2018 铁皮石斛PCR鉴定

准PCRidentificationofDendrobiiOfficinalisCaulis中华中医药学会发布I III 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 36.2三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris- 3 3 3 3 36.710×PCR缓冲液 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 8 10 18本标准起草单位：中国中医科学院中药资源中心、浙江省食品药品检验本标准主要起草人：袁媛、黄璐琦、马临科、蒋超、李文庭、赵玉洋、祝明、赵维良、周骏辉、1铁皮石斛PCR鉴定本标准规定了使用PCR鉴定铁皮石斛药材和饮片、种子种苗的通用方法和要求。GB/T6682分析实验室用水规格和试验按一定规则取自某一整体，能反映该整体的相关信息，可以作为判断该整体情况的一个或多个部从测试样本中分离出DNA的方法。聚合酶链式反应polymerasechainreacti一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，即DNA片段的特异性体外扩增过程，其特异性依赖于与目的DNA片段两端互补的寡核苷酸引物。一般使用对照样品代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程。2以水代替送检样品同法DNA提取、靶核酸扩增和产物检测过程。根据铁皮石斛与其他石斛近缘种核酸序列的差异位点，设计铁皮石斛鉴定特异性引物。利用两步十六烷基三甲基溴化铵法（两步CTAB法）提取样品DNA，以提取DNA为模板进行PCR扩增，获得的5.2金属浴5.3制冰机5.4涡旋振荡器5.5超纯水发生器（分子生物学级别）5.9凝胶成像仪5.10核酸蛋白仪35.12连续可调微量移液枪5.13低温冰箱除另有规定外，实验试剂为不含DNA和DNA酶的分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682的要求；所配制的试剂均应灭菌后保存，并在容器上注明试剂名称、浓度、配制时间、保存条件、失效在800mL去离子水中溶解12.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。室温后用氢氧化钠调节溶液pH值至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。含有2%（2g/100mL）CTAB，100mmol/LTris-HCl（pH8.020mmol/LEDTA（pH8.040mLEDTA(0.5mol/L,pH8.0)，146.1gNaCl溶解后加灭菌去离子水至900mL，使用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调整pH至8.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。含有等量dATP、dCTP、dGTP、dTTP，使用时调整浓度至10mmol/L。依据不同类型的热稳定性DNA聚合酶（Taq酶）选择对应的10×PCR缓冲液。4TPSH-AS1F：5'-CTGCTGAGATAAAATCCACCTPSH-AS1R：5'-ATGCACATCCGAGCCTTAA泳后应出现100bp、250bp、500bp、750bp、1000在80mL去离子水中溶解溴酚蓝250mg，二甲苯氰FF250mg，蔗糖40g，加水定容至100mL，分装。作间不同隔离区域进行，进入各区域应严格按照单一方向进行，即样品制备区→核酸制备区→扩增区送检样品可分成2批，每批可分为同样的3份，总量不低于100g。收样并在样品袋上贴上标签，填写采集数据表。对商品包装和送样说明进行拍照记录，照片随样品一起备送检样品抽样方法参照《中华人民共和国药典》（四部）药材和饮片取样法（通则021样。去除药材和饮片表面附着物，依次使用75%乙醇和无菌双蒸水擦拭表面后晾干。5取测试样品置乳钵、匀浆机或球磨粉碎仪中称取经预处理的送检样品0.05g粉末置2.0mL的微量离心管中，加入已灭菌的前处理缓冲液保温20min，12000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀加入1000μL已高压灭菌的前处理缓冲液，混匀，再65℃水浴保温10min，12000r/min离心10min，弃去上清液；重复此步骤一次；沉淀加结束后取出冷却至室温；加入900μL氯仿-异戊醇（体积比24:1充分振荡混匀，12000r/min离心10min；转移750μL上清液至另一新的2.0mL的微量离心管中，加入750μL氯仿-异戊醇（体积比24：1充分振荡混匀，12000r/min离心10min；转移500μL上清液至另一新的2.0mL的微量离心管中，加入330μL异丙醇溶液，置–20℃放置1h；取出，12000r/min离心10min，弃去上清液，入无水乙醇500μL漂洗1min，12000r/min离心5min，弃去上清液；将具有DNA沉淀的微量离心管首次使用本方法时，应校对PCR仪温控准确性，并使用阳性对照和阴性对照以核对使用的Taq酶或PCR预混液的适用性。PCR检测应重复2次，并设置阳性对照、阴性对照（可选择金钗石斛DendrobiumnobileLindl.、30s,62℃30s,72℃30s),72℃延伸7min。取出PCR管6PCR反应结束后在PCR反应体系内加入2μL100×SYBRGreenI染料，混匀后于365nm紫外波长下取PCR扩增产物，加入5μL6×上样缓冲液混匀后于GelRed染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，若送检样品PCR产物出现与阳性对照相同的荧光、且空白对照无荧光即为阳性，否则为阴性。若阴性对照和空白对照无条带，送检样品PCR扩增条带的大小与阳性对照扩增条带一致并位于9结果报告9.1一般要求9.2鉴定报告样品经检测后，实验室应根据实验的具体操作程序和结果做好详细的实验记录，出具检测报告。h）特定方法取得的结果；k）其它需要报告的内容。7检测结果应来自同一实验室样品的两份测试样品。当一份测试样品的结果为阳性，另一份为阴性还需要检测模板DNA的质量，每个样品应至少制备两份DNA（提取重复）必要时需检测模板DNA的质量，确保提取的DNA片段大于扩增片段。如果经过两次以上从核酸提取开始的重复检测，检测结果不一致，可在测试报告中表述该实验室样品的测试结果为阴性，并注明定量检测和定性检测方法的检测检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理，有毒有害废弃物应经过除害再进行处理，处8本方法适用于从富含多糖、淀粉的植源性中药中快速提取DNA。两步CTAB法：CTAB是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖，而在能够去除大部分多糖、蛋白质等杂质，本方法达到了提高DNA纯度和保证得率的双重效果。A.3试剂和材料A.4仪器A.5DNA提取步骤离心10min；9f）转移上层清液至另一新的2.0mL的微量离心管中，注意不要取到沉淀，加入等体积氯仿-异戊），g）转移上层清液至另一新的2.0mL的微量离心管中，注意不要取到沉淀，加入2/3体积的异丙醇铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimuraetMigo的干燥茎，收载于《中华出现用石斛属其他物种鱼目混珠作为“铁皮石斛”的现象。文献调查表明，铁皮石斛的伪品主要包括齿瓣石斛、重唇石斛、鼓槌石斛、金钗石斛、美花石斛、细茎石斛、短棒石斛、流苏石斛等石斛属近缘物种，其形态和化学成分相似，尤其铁皮石斛的加工制品如枫斗、干条等原植物形态特征已破坏，子标记研究，研究者对中国大陆的石斛属物种进行了系统收集并研究其系统发育关系，表明铁皮石斛行序列比较，找到铁皮石斛单核苷酸多态性（SNP）位点，设计鉴定引物TPSH-AS1F：5'-存于中国中医科学院中药资源中心和中国科学院植物研究所。样本信息详见表B.1。1Dendrobiumofficinale2D.officinale3D.officinale4D.officinale45D.officinale46D.moniliforme7D.wilsonii18D.henanense29D.clavatum4D.hookerianum3D.devonianum3D.lohohens1D.loddigesii1D.henryi3D.gratiosissimum2D.capillipes1D.chrysanthum4D.crepidatum6D.falconeri3D.brymerianum3D.harveyanum3D.hancockii2D.pendulum2D.crystallinum2D.hercoglossum1D.christyanum2D.densiflorum7D.fanjingshanense4D.longicornuD.willamsonii8D.salaccense2D.strongylanthum8D.aduncum5D.monticolaSummerh12D.menglaensis1D.exile4D.porphyrochilum4D.acinaciforme3D.sinense6D.bellatulum4D.sino-minutiflorum4D.MyakiiD.myakii1D.thyrsiflorum5D.stuposum1D.okinawense1D.RuckeriD.ruckeri2D.hainanensis3D.trigonopus1D.wangliangii2D.transparens2D.wattii4D.nobile6D.xichouense1D.cucullatum3D.chrysotoxum5D.compactum1D.PulchrumD.pulchrum1D.sulcatum1D.moschatum1D.pachyglossumD.pachyglossum1D.fimbriatum1D.ellipsophyllum1D.heterocarpum1D.senile1D.polyanthum1D.dixanthum3D.cariniferum1D.wardianum1D.pseudotenellum1D.chryseum1D.unicum1D.jenkinsii2选取无霉变的待测干燥药材标本1g，置于粉碎机中研磨粉碎至可过40目筛；将0.05g粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入1000μL已灭菌的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）沉淀液（配方：2%温10min，12000r/min离心10min，弃上层清液；重复此步骤一白对照。阳性对照为经过中国科学院植物研究所金效华博士鉴定的正品铁皮石斛，阴性对照为非铁皮10mmol·L-1dNTPs，0.5UrTaq酶（5U·µl-11µlDNA模板，加入铁皮石斛鉴定引物M:DL2000DNA分子量标准图B.3。为保证结果的稳定性和准确性，后续选择35个循环进行PBiosystem公司)；TC-512得到397bp的亮带，阴性对照在此范围内