细胞凋亡和细胞坏死

细胞凋亡（科普诗）似秋叶凋零，告别生命之辉煌；那难以计数攻击、诱导，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命末端；啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡;细胞凋亡和细胞坏死第1页细胞凋亡（科普诗）似秋叶凋零，告别生命之辉煌；那难以计数攻击、诱导，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命末端；啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡;细胞凋亡和细胞坏死第2页危难中细胞啊，你沉稳不乱，DNA片片切割，化云梯直通天堂；细胞体分团相聚，把生命凝重浓集在小体上；分别了朝夕相处搭档，再见了高兴美好时光；这一切一切又融入临近胞体，腾出空间再写生命篇章。

细胞凋亡和细胞坏死第3页细胞死亡形式1.细胞坏死因为比较强烈有害刺激或细胞内环境严重紊乱而造成细胞死亡。2.细胞凋亡由体内外原因触发细胞内预存死亡程序而造成细胞死亡过程称为细胞凋亡（apoptosis),又称程序性细胞死亡（programmedcelldeath,PCD)。细胞凋亡和细胞坏死第4页细胞凋亡和细胞坏死第5页

坏死凋亡1.性质病理性,非特异性生理性或病理性，特异性2.诱导原因强烈病理性刺激,随机发生生理性或较弱病理性刺激,非随机发生3.生化特点被动过程,无新蛋白合成,不耗能耗能主动过程，有新蛋白合成4.形态改变细胞结构全方面溶解、破坏、细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩,膜可发泡成芽,形成凋亡小体5.DNA电泳弥散性降解，电泳呈均一DNA片状DNA片段化（180-120bp）,电泳呈“梯”状条带6.炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应7.凋亡小体无有8.基因调控无有细胞凋亡与坏死比较细胞凋亡和细胞坏死第6页细胞凋亡生理和病理意义1.确保正常发育、生长:指趾间隙形成；2.维持内环境稳定:组织细胞更新(上皮组织/血细胞/衰老细胞)、生理器官内分泌调控（子宫产后复员/月经期子宫内膜脱落）、受损不能修复细胞或突变细胞去除；3.发挥主动防御功效：病原微生物宿主细胞发生主动凋亡。细胞凋亡和细胞坏死第7页细胞凋亡与疾病发生机制新认识1.该“死”细胞（如肿瘤细胞、本身反应性免疫细胞）未死，是造成肿瘤、本身免疫性疾病主要发病机制之一。——细胞凋亡不足2.不该“死”细胞（如神经元、心肌细胞）死了，这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等发病相关。——细胞凋亡过分细胞凋亡和细胞坏死第8页细胞凋亡过程1.凋亡信号转导2.凋亡基因激活3.细胞凋亡执行4.凋亡细胞去除细胞凋亡和细胞坏死第9页凋亡过程及分期

诱导期执行期消亡期

凋亡诱导因素受体cAMPCa2+神经酰胺死亡信号凋亡相关基因激活Dnase激活Capases激活巨噬细胞吞噬细胞凋亡细胞细胞凋亡和细胞坏死第10页凋亡时细胞主要改变一、细胞凋亡形态学改变1.细胞膜改变：微绒毛、细胞突起和细胞表面皱褶消失；胞膜空泡化，内质网不停扩张并与胞膜融合形成芽状突起（出芽）；2.细胞质改变：胞质浓缩、细胞器改变（线粒体变大脊增多可空泡化，内质网腔扩大提供包裹膜）；3.细胞核改变：核内染色质浓缩边集空泡化、固缩、出芽、边集、凋亡小体（apoposisboby）细胞凋亡和细胞坏死第11页最早期形态学改变是细胞间间接丢失与邻近细胞脱离并失去微绒毛胞浆浓缩及核质密度增高（DNA断裂）凋亡小体识别、吞噬（无炎症反应）细胞凋亡和细胞坏死第12页

经典凋亡小体（apoposisboby）：由透亮空泡和不透光浓密核碎片两部分组成。细胞凋亡和细胞坏死第13页胸腺细胞正常凋亡细胞凋亡和细胞坏死第14页胸腺细胞正常凋亡细胞凋亡和细胞坏死第15页细胞凋亡生化改变1.DNA片段化“梯”状条带2.内源性核酸内切酶激活及其作用3.凋亡蛋白酶（caspases）激活及其作用细胞凋亡和细胞坏死第16页1.DNA片段化“梯”状条带为细胞凋亡主要特征①几乎全部凋亡细胞都有核小体间裂解，造成DNA断裂；②DNA降解过程特异性：不伴有组蛋白和其它核蛋白降解；③染色质在核小体间裂解是凋亡细胞和形态改变基础；④DNA片段化是凋亡“黄金标识”。细胞凋亡和细胞坏死第17页细胞凋亡和细胞坏死第18页2.内源性核酸内切酶激活及其作用由一系列胞内信号转导步骤激活，执行染色质DNA切割细胞凋亡和细胞坏死第19页3.Caspase9激活，需要经过CARD（caspase-recruitmentdomain)、Apaf-1、细胞色素c、ATP等多个因子参加1.灭活细胞凋亡抑制物（如Bcl-2）；2.水解细胞蛋白质结构，造成细胞解体，形成凋亡小体（apoposisboby）；3.在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使该蛋白取得或丧失某种生物学功效Caspases在凋亡中主要作用细胞凋亡和细胞坏死第20页细胞凋亡调控（一）细胞凋亡相关原因1.诱导性原因2.抑制性原因

(二)细胞凋亡信号转导细胞凋亡和细胞坏死第21页1.细胞凋亡诱导原因.生理活性因子：TNF家族（Fas-L,TNF)、TGF、神经递质(谷氨酸、多巴胺)、生长因子撤退、GC等.损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等.化疗药品.毒素：乙醇、β-淀粉样肽细胞凋亡和细胞坏死第22页2.细胞凋亡抑制原因.凋亡相关基因抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。.生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒E1B、杆状病毒p35、棒状病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBVBHRF1等.药品：Calpain抑制剂、caspases抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等细胞凋亡和细胞坏死第23页(二)细胞凋亡信号转导

-凋亡信号转导系统特点①多样性：不一样种类细胞系统不一样②偶联性：与增殖分化信号系统交叉偶联③同一性：多原因，共用同一系统触发④多途性：同一诱导原因开启多条信号转导路径细胞凋亡和细胞坏死第24页㈡细胞凋亡信号转导诱导信号cellR神经酰胺多路径RSAPK/JNKP53基因NF-kB,JNK/AP-1路径激活baxor下调bcl-2ROSmtDNA细胞凋亡和细胞坏死第25页㈢细胞凋亡相关基因抑制凋亡基因：bcl-2促进凋亡基因：fas，P53双向调控基因：c-myc，bclx细胞凋亡和细胞坏死第26页Bcl-2抗凋亡机制①直接抗氧化②抑制线粒体释放促凋亡蛋白质③抑制促凋亡Bax，Bak细胞毒作用④抑制Caspases激活⑤维持细胞钙稳态细胞凋亡和细胞坏死第27页细胞凋亡发生机制（一）氧化损伤（二）钙稳态失衡(三)线粒体损伤细胞凋亡和细胞坏死第28页（一）氧化损伤机制氧自由基可破坏机体正常氧化/还原动态平衡，造成生物大分子氧化损伤，干扰正常生命活动，形成严重氧化应激状态——后果：诱导细胞凋亡。细胞凋亡和细胞坏死第29页（二）钙稳态失衡引发细

胞凋亡可能机制1.激活Ca2+/Mg2+依赖核酸内切酶(DNase)，降解DNA链；2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因转录；4.Ca2+在ATP配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间连接区内酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA。细胞凋亡和细胞坏死第30页细胞凋亡生物学意义1.发育从低等动物到高等动物发育，都存在着程序性细胞死亡现象。2.免疫系统淋巴细胞发育分化成熟过程中，一直伴伴随细胞凋亡。3.衰老细胞凋亡与许多年纪相关疾病有直接或间接联络。4.损伤与修复5.肿瘤发生细胞增殖与死亡速度平衡失调。6.病毒致病病毒表示抗凋亡蛋白。细胞凋亡和细胞坏死第31页细胞凋亡和细胞坏死第32页细胞凋亡检测伴随研究技术提升和对凋亡认识不停深入，检测凋亡方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。1.形态学检测2.DNA降解分析3.凋亡酶学分析4.凋亡相关蛋白分析5.流式细胞分析细胞凋亡和细胞坏死第33页一．细胞凋亡形态学分析细胞凋亡形态学改变主要表现为：细胞皱缩(cellshrinkage)，失去细胞连接(celljunction)，微绒毛(microvilli)消失，发泡(blebbing)，染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩新月状体(crescents)，形成凋亡小体(apoptoticbody)等。细胞凋亡和细胞坏死第34页细胞凋亡形态学检测方法检测方法可判定凋亡细胞特征光学显微镜相差显微镜透射电镜

聚焦激光扫描电镜扫描电镜流式细胞仪缩时摄影术细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞发泡、凋亡小体微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、凋亡小体凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位细胞膜表面泡状鼓起低前向散射光(FSC)、高侧向散射光(SSC)凋亡细胞形成过程细胞凋亡和细胞坏死第35页二.DNA降解分析DNA降解过程特点：1.发生于凋亡早期，由内源性核酸内切酶激活引发2.DNA在核小体连接部位断裂，产生180－200bp为最小单位单体或寡聚体片断3.DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡小体细胞凋亡和细胞坏死第36页

(一)DNA凝胶电泳原理：凋亡细胞降解产生一系列规则DNA片断，其电泳结果呈经典“梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后坏死细胞DNA分解是随机，产生碎片分子量大小不一，在电泳时形成“涂片状”(smear)。普通琼脂糖凝胶电泳、Southernblotting、放射自显影(32PdATP或32PdCTP连接到DNA片断3’端)细胞凋亡和细胞坏死第37页(二)原位标识法TUNEL(TdTmediateddUTPnick

endlabeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导原位缺口末端标识技术。原理：在TdT作用下，带有标识物dUTP被连接在断裂DNA3’末端，然后经过对应方法检测标识物，从而判断是否有凋亡发生。应用范围：石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养细胞、组织中分离细胞 细胞凋亡和细胞坏死第38页(三)ELISA法

原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入标本，凋亡细胞核小体可与抗体结合，再加入抗-DNA片断-POD复合物，与核小体中DNA片断结合，最终加入POD显色底物，以酶标仪测定光密度以进行定量分析。细胞凋亡和细胞坏死第39页三.凋亡酶学分析1.内切核酸酶(endonuclease,DNase)

种类：DNaseⅠ（内质网、高尔基体),DNaseⅡ（溶酶体、胞核)，NUC18（胞核，胸腺细胞中)等

作用：使DNA断裂成180－200bp或其倍数片断

激活机制：CAD(caspase-activateDNase)ICAD(inhibtorofCAD)

检测：WesternBlotting细胞凋亡和细胞坏死第40页Caspases检测

1.Caspase-3活性测定(FI