微生物培养基的配制和灭菌

微生物培养基配制和灭菌目标要求试验材料试验程序微生物培养基的配制和灭菌第1页目要求了解培养基配制原理和方法，掌握其配制过程。了解几个灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法原理及其使用方法。熟悉分离、培养微生物前相关准备工作及操作方法。微生物培养基的配制和灭菌第2页实验材料药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O等。高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。其它：天平、牛角匙、电炉、2MHCl、2MNaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠三角瓶、带棉塞无菌试管、无棉塞空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防水纸、绳索、棉花、标签等。微生物培养基的配制和灭菌第3页实验程序培养基配制分离培养微生物惯用器皿准备培养基和玻璃器材灭菌方法微生物培养基的配制和灭菌第4页试验程序1:培养基配制培养基培养基配制标准培养基种类培养基配制方法和步骤培养基配方及配制无菌水制备微生物培养基的配制和灭菌第5页

培养基是人工配制适合于不一样微生物生长繁殖或积累代谢产物营养基质。它是进行科学研究，发酵生产微生物制品等基础。微生物培养基的配制和灭菌第6页培养基配制标准一、营养成份二、PH值三、渗透压四、氧化还原电位微生物培养基的配制和灭菌第7页一、营养成份总体标准

1.依据不一样微生物营养需要配制不一样培养基，如自养型微生物：由简单无机物质组成异养做生物：最少需要含有一个有机物质。

按微生物主要类群来说，又有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌之分。它们所需要培养基成份也不一样，分别称为牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号合成培养基，麦芽汁培养基，查氏合成培养基。培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第8页

能源指能为微生物生命活动提供最初能量起源营养物或辐射能。

微生物能源谱：

培养基配制标准有机物：化能异养微生物（同碳源）无机物：化能自养微生物（不一样于碳源）化学物质辐射能：光能自养和光能异养微生物能源谱：微生物培养基的配制和灭菌第9页

化能自养微生物能源物质都是一些还原态无机物质，比如：NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+等，能利用这些物质作为能源全部是细菌，如：硝酸细菌、亚硝酸菌、硫化细菌、硫细菌、铁细菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。这些无机养料经常是双功效（如：NH4+既是硝酸细菌能源，又是它氮源。）

有机营养物常有双功效或三功效作用，既是异养微生物能源，又是它们碳源或氮源。辐射能是单功效，只为光能微生物提供能源。培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第10页

2.注意各种营养物质浓度与配比

营养物浓度：营养物质浓度太大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长需要。

各营养物质之间浓度比：尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比普通指培养基中元素碳与元素氮比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成份含量之比）影响更为显著。培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第11页营养成份碳源氮源矿物质生长因子水分培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第12页

碳源（carbonsource）凡是提供微生物营养所需碳元素（碳架）营养源，称为碳源。

碳源物质功效：组成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要能量（异养微生物）。

微生物碳源谱无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。有机含碳化合物：糖与糖衍生物、脂类、醇类。有机酸、烃类、芳香族化合物以及各种含氮化合物。

培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第13页

氮源(nitrogensource)

凡是提供微生物营养所需氮元素营养源，称为氮源。

氮源物质主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长氮源与能源，一些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏条件下，也能够利用氨基酸作为能源物质。

无机氮源：碳酸铵、硝酸盐、硫酸铵、尿素

有机氮：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。

生产上惯用氮源有硝酸盐、铵盐、尿素、氨以及蛋白含量较高鱼粉、蚕蛹粉、黄豆饼粉、花生饼份、玉米浆等。

培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第14页二.控制培养基PH值细菌与放线菌生长pH在7—7.5之间，酵母菌与霉菌生长pH值在4-5之间。在微生物生长和代谢过程中，因为营养物质利用和代谢产物形成与积累，常会改变培养基pH值，为了维持培养基pH值相对恒定，通常采取以下两种方式：内源调整：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性碳酸盐；调整培养基碳氮比。外源调整：按实际需要流加酸或碱液培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第15页三、渗透压注意营养物质要有适合浓度，不能太低满足不了生长需要，太高则渗透压太大，也会抑制微生物生长培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第16页四、氧化还原电位氧化还原电位越高，培养基氧化活动越强，在厌氧菌培养中，加入还原剂，可降低自由氧毒害。培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第17页培养基种类据组成成份可分为:

1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定百分比配制而成。2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。3.天然培养基：利用天然起源有机物配制而成。从培养基物理状态可分为1.液体培养基：不加凝固剂（惯用凝固剂为琼脂）液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右凝固剂固体状态培养基或农副产品培养基。3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而成半固体状培养基。微生物培养基的配制和灭菌第18页按照培养基用途，可将其分为1.加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物（或植物）组织液或其它营养物质（或生长因子）一类营养丰富培养基，用以培养某种或某类营养要求苛刻异养微生物2.选择培养基：选择培养基是依据某种或某一类群微生物特殊营养需要或对某种化合物敏感性不一样而设计出来一类培养基。利用这种培养基能够将某种或某类微生物从混杂微生物群体中分离出来。3.判别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应指示剂或化学药品，从而产生某种显著特征性改变，以区分不一样微生物培养基配制标准微生物培养基的配制和灭菌第19页培养基配制方法和步骤称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调pH值：用2MNaOH或2MHCl调pH，用pH试纸对照。加琼脂溶化：加热过程中要不停搅拌，可适当补水。分装：注意不要污染棉塞。包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。微生物培养基的配制和灭菌第20页配制方法和步骤微生物培养基的配制和灭菌第21页配制方法和步骤微生物培养基的配制和灭菌第22页配制方法和步骤微生物培养基的配制和灭菌第23页注意事项培养基配方在附录Ⅱ按照每组安排来配制，每人配不一定都相同按照书上百分比，但总量有变（全部配方均为1000ml量，同学们需要依据不一样要求换算）配溶液调PH值加琼脂粉灭菌（在老师监督下进行）普通微生物培养基配制能够使用自来水，在细胞培养以及分子试验中需要区分对待微生物培养基的配制和灭菌第24页试验程序2:分离培养微生物惯用器皿准备清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。棉塞制作包装培养皿和吸管等。

微生物培养基的配制和灭菌第25页湿热灭菌法原理湿热灭菌法菌体吸收水分蛋白质较易凝固湿热穿透力比干热大，水传热能力比许多非导体固体强湿热蒸汽有潜热存在，1g水在100℃由液态变为固态可放出2.26kJ，可增强灭菌效果微生物培养基的配制和灭菌第26页培养基和玻璃器材灭菌方法空气膨胀压大于水蒸气膨胀压微生物培养基的配制和灭菌第27页试验程序3:培养基和玻璃器材灭菌方法干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器加压蒸汽灭菌法其步骤以下：1.灭菌器内加入一定量水，将用防水纸包扎好物品放入其中。2.接通电源，进行加热。3.排除高压锅内冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。4.当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2,0.1MPa）时，此时灭菌器内温度为1210C，维持20-30min。对热不稳定培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力(0.06MPa,约112.60C)，30min。5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。培养基和玻璃器材灭菌方法微生物培养基的配制和灭菌第28页微生物培养基的配制和灭菌第29页微生物培养基的配制和灭菌第30页培养基和玻璃器材灭菌方法微生物培养基的配制和灭菌第31页间歇灭菌法：待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，天天蒸煮1次，每次煮沸1h，连续3d重复进行。在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在370C恒温条件下培养过夜，这么能够使每次蒸煮后未杀死残留芽孢萌发成营养体，方便下次蒸煮时杀灭。培养基和玻璃器材灭菌方法微生物培养基的配制和灭菌第32页过滤除菌法：不能用加热灭菌液体物质（如维生素、血清），普通可用细菌过滤器进行除菌。培养基和玻璃器材灭菌方法微生物培养基的配制和灭菌第33页紫外线灭菌法：普通30W灯管，9m3空间，距地面2m每次打开紫外线照射0.5h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，所以只适合用于空气及表面杀菌。培养基和玻璃器材灭菌方法微生物培养基的配制和灭菌第34页化学药剂消毒灭菌：微生物试验室中惯用化学杀菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有是杀菌剂，有是抑菌剂。培养基和玻璃器材灭菌方法微生物培养基的配制和灭菌第35页培养基配制标准配制培养基配方，及方法培养基蒸汽灭菌原理，方法微生物培养基的配制和灭菌第36页牛肉膏蛋白胨琼脂培养基AmpR细菌分离培养基成份牛肉膏0.3g;蛋白胨1g;氯化钠0.5g;琼脂2g;蒸馏水

100mL;pH7.0～7.2;灭菌1.05kg/cm2，20-25min用量：100-150mL/行；制备8-10个平板；2个/组（涂布/划线）制作斜面（只需1个组制备）：无需抗生素配制方法微生物培养基的配制和灭菌第37页牛肉膏蛋白胨琼脂培养基-2配制方法称量：按培养基配方百分比依次准确称取。注意：牛肉膏、蛋白胨。溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一溶化培养基各成份。调pH：注意pH值不要调过头，以防止回调。定容：待各成份完全溶化后，补足水量至所需体积。加琼脂（固体培养基）：加入所需琼脂量，加热融化，补足失水。分装、加塞、标识、包扎：分装入试管内或三角烧瓶内。注意：不要使培养基沾在管口或瓶口上。

(1)液体分装分装高度以试管高度1/4左右为宜。

(2)固体分装分装试管，其装量不超出管高1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶量以不超出三角烧瓶容积二分之一为宜。

(3)半固体分装试管普通以试管高度1/3为宜，灭菌后垂直待凝。灭菌：121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。抗生素等生物活性物质添加：临用前加入，约55℃，按比列添加（终浓度10-60ug/mL）。制作平板or斜面：搁置斜面长度以不超出试管总长二分之一为宜。无菌检验：将灭菌培养基放入37℃温室中培养24-48小时，以检验灭菌是否彻底。微生物培养基的配制和灭菌第38页马丁培养基淀粉降解真菌分离培养基成份葡萄糖2.5g蛋白胨1.25g；KH2PO4·3H2O0.25g;MgSO4·7H2O0.125g;0.1％孟加拉红溶液0.83ml;琼脂3.8～5g;蒸馏水250ml;自然pH;用量：250mL/行；制备12个平板；2个/人（涂布/划线）制作斜面：无需抗生素配制方法微生物培养基的配制和灭菌第39页马丁培养基-2配制方法称量：称取培养基各成份所需量。溶化：在烧杯中加入约2/3所需水量，然后依次逐一溶化培养基各成份。按每250ml培养基加入0.83ml0.1％孟加拉红溶液。定容：待各成份完全溶化后，补足水量至所需体积。加琼脂（固体培养基）：加入所需琼脂量，加热融化，补足失水。分装、加塞、标识、包扎。灭菌：高压蒸汽灭菌121．3℃，20min。临用前，加热融化培养基，候冷至60℃左右，按每100ml培养基无菌操作加入2ml2％去氧胆酸钠溶液及0.33ml链霉素溶液（10000u/ml），快速混匀。制作平板or斜面用量：250mL/行；制备12个平板；2个/人（涂布/划线）制作斜面（6支），4支无菌试管，1瓶50ml无菌水微生物培养基的配制和灭菌第40页高氏I号培养基产色素放线菌分离培养基成份溶性淀粉2g;KNO30.1g;K2HPO40.05g;MgSO4•7H2O0.05g;NaCl0.05g;FeSO4•7H2O0.001g（母液）;琼脂2g;自来水100mL;pH7.2～7.4;灭菌1.05kg/cm2，20-25min用量：100-150mL/行；制备8-10个平板；2个/组（涂布/划线）制作斜面（只需1个组制备）：无需抗生素配制方法微量元素（母液）pH微生物培养基的配制和灭菌第41页样品制备及目标微生物分离梯度稀释：无菌操作称取检样25克土（或25mL），放入含有225mL灭菌水玻璃三角瓶中(0.5g/5mL)，振摇30min，即为1：10稀释液，依次做1：100、1：1000……稀释。依据对样品污染情况预计，选择2-3个适当稀释度，涂布（100-200ul稀释液）or划线（稀释原液）or450C混合共培养（0.5-1.0mL稀释液）标识并培养：平皿底；平皿倒置；28～37℃

恒温培养细菌/真菌/放线菌=37/28/28℃合理安排时间，协作多出平板和斜面写上班级和组号，交汪老师供转接使用准备下个班级公用试验材料（无菌水、三角瓶、试管等）微生物培养基的配制和灭菌第42页思索题培养基中加琼脂作用是什么？干热灭菌、高压蒸汽灭菌和间歇灭菌场所有何不一样？怎样检验培养基灭菌是否彻底？微生物培养基的配制和灭菌第43页注意事项培养基配方在附录Ⅱ按照每组安排来配制，每人配不一定都相同按照书上百分比，但总量有变（标准配方均为1000ml量，同学们需要依据不一样要求换算）配溶液调PH值加琼脂粉灭菌（在老师监督下进行）普通微生物培养基配制能够使用自来水，在细胞培养以及分子试验中需要区分对待微生物培