微生物的纯培养和显微技术

一、序言1、微生物研究对象：群体2、研究基础：1）纯培养技术：把特定微生物从自然界混杂存在状态中分离、纯化出来技术。

●培养物：在人为要求条件下培养、繁殖得到微生物群体称为培养物。●纯培养物：只有一个微生物培养物。2）显微技术：包含显微标本制作、观察、测定、分析和记录。微生物的纯培养和显微技术第1页培养基微生物的纯培养和显微技术第2页二、微生物操作基本技术——无菌技术1、微生物培养惯用器具及其灭菌1）惯用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿、接种环（针）、无菌操作台、酒精灯等2）灭菌：

●灭菌(sterilization)：杀灭物体上全部微生物方法。即采取强烈理化原因使任何物体内、外部一切微生物永远丧失其生长繁殖能力办法。它比消毒要求高，包含杀灭细菌芽胞在内全部病原微生物和非病原微生物。如高温、辐射、超声波和激光等。

微生物的纯培养和显微技术第3页●消毒(disinfection)：杀死物体上病原微生物方法，并不一定能杀死含芽胞细菌或非病原微生物。即仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害病原菌，而对被消毒生物基本无害措施用以消毒药品称为消毒剂(disinfectant）●抑菌(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用抑菌剂为各种抗生素。●防腐(antisepsis)：利用某种理化原因完全抑制霉腐微生物生长繁殖而对被消毒物体基本无害办法。如低温、缺氧、干燥、高酸、高渗或防腐剂。细菌普通不死亡。●无菌(asepsis)：不存在活菌。微生物的纯培养和显微技术第4页（1）惯用物理消毒灭菌方法

●热力灭菌法；●辐射杀菌法；●滤过除菌法；●超声波杀菌法。

A、

热力灭菌法●干热灭菌法▲焚烧：废弃物、尸体；▲灼烧：接种环、试管口；▲干烤：玻璃器皿；▲红外线：医疗器械。●湿热灭菌法Ⅰ）常压下：●巴氏消毒法：61.6-62.8℃30min或71.7℃15-30s,主要用于牛乳消毒。●煮沸法；微生物的纯培养和显微技术第5页巴氏消毒方法有几个？一个是将牛奶加热到62-65℃，保持30分钟。这种方法当前在广东较少使用。采取这一方法，可杀死牛奶中各种生长型致病菌，灭菌效率可达97.3%-99.9%，经消毒后残留只是部分嗜热菌及耐热性菌以及芽孢等，但这些细菌占多数是乳酸菌，乳酸菌不但对人无害反而有益健康。第二种方法将牛奶加热到75-90℃，保温15-16秒，其杀菌时间更短，工作效率更高。但杀菌基本标准是，能将病原菌杀死即可，温度太高反而会有较多营养损失。

微生物的纯培养和显微技术第6页●间歇蒸汽消毒法：80-100℃15-60min,37℃过夜，循环三次。主要适合用于不耐热培养基灭菌。Ⅱ）加压下：●连续加压灭菌：135-140℃下处理5-15s，主要适合用于大规模发酵工厂培养基灭菌；●常规加压灭菌：121℃（压力：1kg/cm2或15磅/英寸）15~20min，是一个最为广泛灭菌方法。▲注意灭菌物体含菌量影响，含菌量越高灭菌时间越长。天然原料＞化学试剂▲空气排除程度，必须尽可能驱尽锅内空气。是依靠温度而不是压力来到达灭菌目标。15磅/英寸：纯蒸汽121℃；排除1/2空气：112

℃；不排除空气：100

℃。微生物的纯培养和显微技术第7页灭菌锅微生物的纯培养和显微技术第8页

▲灭菌对象体积；50ml(12min),ml(30min)▲灭菌对象pH值：pH＜6.0最易死亡；而pH6.0~8.0时，微生物最不易死亡。

▲加热与散热速度。B、辐射杀菌法；

●

紫外线：波长200-300nm紫外线含有杀菌作用。其主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻两个胸腺嘧啶共价结合形成二聚体，造成细菌变异和死亡。

●电离辐射：高速电子、X射线、γ射线

微生物的纯培养和显微技术第9页洁净工作台微生物的纯培养和显微技术第10页●微波：波长1mm~1mC、过滤除菌法

●赛氏滤器；●玻璃滤器；●薄膜滤器D、超声波杀菌法

●是一个机械作用原因，每秒超出2万次振动声波即为超声波。惯用超声波发生器能产生20-100千赫声波。可使细菌细胞壁裂解而死亡。

微生物的纯培养和显微技术第11页超声仪微生物的纯培养和显微技术第12页（2）化学消毒剂：●消毒剂种类：酚类、醇类、重金属盐类、氧化剂、表面活性剂、烷化剂。●消毒剂应用：病人排泄物与分泌物、皮肤、粘膜、饮水、厕所、空气、手。微生物的纯培养和显微技术第13页3）接种操作●用接种环或接种针分离分离微生物或在无菌条件下把微生物由一个培养皿转接到另一个培养皿进行培养。

图-2-1无菌操作转接培养物无菌操作箱紫外照射30min以上；靠近火焰。微生物的纯培养和显微技术第14页三、微生物分离和纯培养●菌落：单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度能够形成肉眼可见、有一定形态结构子细胞生长群体，称为菌落。●菌苔：许多菌落连成一片称为菌苔。●培养基：培养微生物营养物质。惯用有：肉汤、LB培养基等。●固体培养基：用琼脂或其它凝胶物质固化培养基。惯用1.5%琼脂。●平板：即培养平板简称，它是指熔化固体培养基倒入平皿冷却凝固后，盛有固体培养基培养皿。微生物的纯培养和显微技术第15页一）优势微生物分离纯培养1、用固体培养基分离纯培养●稀释倒平板法

缺点：热敏感细菌易死亡；影响严格好氧菌生长。●涂布平板法注意：平板不能太干也不能太湿，同时不能损坏平板。

●平板划线分离法

★扇形；★连续划线；★方格划线。注意：不能损坏平板。●稀释摇管法

★适宜于严格厌氧菌；★步骤同稀释倒平板法。微生物的纯培养和显微技术第16页微生物的纯培养和显微技术第17页灭菌液体石蜡何固体石蜡混合物微生物的纯培养和显微技术第18页2、用液体培养基分离纯培养

★适宜于不能在固体培养基上生长微生物如一些细胞大细菌、原生动物和藻类；

★最终一个稀释度95%表现为不生长。二）劣势微生物分离纯培养1、单细胞分离

★必须借助于低倍显微镜（较大微生物）或显微操作仪

（较小微生物）；

★对操作技术要求高，多限于高度专业化科学研究。

微生物的纯培养和显微技术第19页2、选择培养分离★适宜于从自然界中分离、寻找有用微生物或劣势生长微生物。1）利用选择培养基直接分离●原理：依据待分离微生物特点选择不一样培养条件。如分离高温菌，可在高温条件下培养；分离某种抗生素抗性菌株可在加有抗生素平板上分离。2）富集培养●原理：利用不一样微生物间生命活动特点不一样，制订特定环境条件，使仅适应于该条件微生物生长（即抑制大多数微生物生长），从而使其在群落中数量大大增加，进而对其进行分离。如分离降解对羟基苯甲酸微生物配置以对羟基苯甲酸为唯一碳源培养基。

微生物的纯培养和显微技术第20页★富集培养是分离微生物最强有力伎俩之一。它能够用来分离培养出由科学家设计特定环境中能生长微生物。微生物的纯培养和显微技术第21页三）二元培养物分离●二元培养物：假如培养物中只含两种微生物，而且有意识地保持其二者之间特定关系培养物称为二元培养物。

★适宜于不能或极难得到纯培养微生物。

★如病毒是二元培养物保留最有效路径，因为病毒是细胞生物严格细胞内寄生物。四）不一样微生物有不一样最适方法，在实践中依据需要采取其最适方法。微生物的纯培养和显微技术第22页四、微生物保藏技术1）目标：为了确保微生物研究和应用工作顺利进行，经过分离纯化微生物必须经过各种保藏技术保藏。2）要求：不死；不被污染；不变异。3）原理：依据菌种特征及保藏目标不一样，给微生物以特定条件，使其存活而得以延续。A：利用培养基或宿主对微生物菌株进行连续接种；B：改变其所处环境条件如干燥、低温、缺氧等令菌株代谢水平降低，乃至完全停顿，到达半休眠或完全休眠状态，使其在一定时间内得以保留。微生物的纯培养和显微技术第23页4）保藏方法（1）传代培养保藏●类型：琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养基●注意：A，在要求时间内接种（普通1个月）B，降低培养物代谢或预防培养物干燥可延长传代保藏时间。

●优点：使用方便。●缺点：

★工作繁琐；★轻易污染；★易造成菌种衰退。

微生物的纯培养和显微技术第24页（2）冷冻保藏●原理：将微生物处于冷冻状态使其代谢作用停顿以到达保藏目标（降低温度）。●方法：★液氮（-196℃）；★-70℃低温冰箱；★-20℃普通冰箱（温度越低越好）●注意：尽可能减小冰晶对细胞（主要是细胞膜）损伤。★速冻；★快速升温；

★加保护剂如甘油（可加到15-50%），二甲亚砜。微生物的纯培养和显微技术第25页液氮罐微生物的纯培养和显微技术第26页

（3）干燥保藏法●原理：干燥使其代谢停顿（降低水分）。●方法：

★沙土管保留：适合用于产孢子微生物如芽孢杆菌、放线菌等。特点：简便易行，并能够将微生物长久保藏。适合于普通实验室及以放线菌等为菌种发酵工厂采取。

★冷冻真空干燥保留：冷冻干燥样品在真空或惰性气体密闭环境中保留，使其生命活动处于休眠，能够到达长久保留目标。特点：用冰升华除去水分伎俩比较温和，细胞受损伤程度相对较小，存活率及保藏效果不错，同时邮寄和使用方便。它是目前使用最普遍、也是最主要微生物保藏方法。

微生物的纯培养和显微技术第27页（4）其它方法

●各种微生物保藏方法还很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。

总之●不一样微生物对不一样保藏方法有不一样适应性，迄今还没有一个方法被证实对全部微生物都适应。

●对于一些比较主要微生物菌株，则要尽可能多采取各种不一样伎俩进行保藏，以免因某种方法失败而造成菌种丧失。微生物的纯培养和显微技术第28页Sect2显微镜和显微技术一、显微镜种类及其原理一）光学显微镜

1、普通光学显微镜（lightmicroscope)

●适于观察染色标本

2、暗视野显微镜（dark-fieldmicroscope)

●适于观察细菌运动性3、相差显微镜（phasecontrastmicroscope)

微生物的纯培养和显微技术第29页●经过特殊光学装置——环状光阑和相差板，利用光干涉现象，将光相位差转变成肉眼能够觉察振幅差（明暗差），从而使原来透明物体表现出显著明暗差异，对比度增强。●适于观察不染色活细胞及细胞内一些细微结构。4、荧光显微镜（fluorescencemicroscope)

●原理：是紫外线、荧光素（如FITC）、抗体分子（必要时）一起工作显微镜。标本用用荧光素覆盖，紫外线直接照射标本。紫外线将荧光染料中电子激发，使之呈高能量水平。然后电子返回到它们初发能量水平时，经过发射不一样颜色光来释放额外能量。

●在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用十分普遍如抗原组织定位等。微生物的纯培养和显微技术第30页

普通光学显微镜分辨率为0.25um。普通细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。微生物的纯培养和显微技术第31页暗视野显微镜微生物的纯培养和显微技术第32页相差显微镜微生物的纯培养和显微技术第33页荧光显微镜微生物的纯培养和显微技术第34页（一）形态和染色球状杆状螺旋状基本形态微生物的纯培养和显微技术第35页一、细胞形态结构及其功效（一）形态和染色1、球状

细胞个体呈球形或椭圆形，不一样种球菌在细胞分裂时会形成不一样空间排列方式，常被作为分类依据。微生物的纯培养和显微技术第36页一、细胞形态结构及其功效（一）形态和染色2、杆状

细胞呈杆状或圆柱形，普通其粗细（直径）比较稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不一样而有较大改变。微生物的纯培养和显微技术第37页枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌微生物的纯培养和显微技术第38页铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）微生物的纯培养和显微技术第39页结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis微生物的纯培养和显微技术第40页炭疽病病原菌-------炭疽杆菌微生物的纯培养和显微技术第41页破伤风梭菌微生物的纯培养和显微技术第42页一、细胞形态结构及其功效（一）形态和染色3、螺旋状弧菌螺旋菌螺旋体菌微生物的纯培养和显微技术第43页弧菌：菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。蛭弧菌霍乱弧菌微生物的纯培养和显微技术第44页螺旋菌：菌体回转如螺旋，螺旋数目和螺距大小因种而异。鞭毛二端生细胞壁坚韧，菌体较硬。微生物的纯培养和显微技术第45页螺旋体菌：菌体柔软，用于运动类似鞭毛轴丝位于细胞外鞘内。梅毒密螺旋体微生物的纯培养和显微技术第46页个体小:测量单位：微米或钠米火星陨石中发觉细菌化石（直径10nm）微生物的纯培养和显微技术第47页

德国科学家H.N.Schulz等1999年在纳米比亚海岸海底沉积物中发觉一个硫磺细菌(sulfurbacterium),其大小可达0.75

mm，Thiomargaritanamibiensis,---“纳米比亚硫磺珍珠”微生物的纯培养和显微技术第48页二）、电子显微镜1、透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope,TEM)●原理：用一束电子作为它能源，电子波长很短，能够检测极细微物体，如病毒和分子。●应用：经过细胞超薄切片，观察细胞内部详细结构如细胞膜、细胞核等。（可放大几万倍）2、扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope,SEM)●原理：类似于电视或电传真照片。即利用电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，激发样品表面