发酵设备及消毒灭菌专家讲座

第三节发酵设备及消毒灭菌1发酵设备及消毒灭菌专家讲座第1页发酵普通流程种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备2发酵设备及消毒灭菌专家讲座第2页发酵设备——发酵罐发酵罐特点轴封严密，泄漏少能承受一定压力、温度搅拌通风装置确保气液充分混合含有足够冷却面积死角少，灭菌彻底适宜径高比（高与直径比值为2.5—4）3发酵设备及消毒灭菌专家讲座第3页发酵罐类型搅拌釜反应器鼓泡式反应器气升式反应器4发酵设备及消毒灭菌专家讲座第4页5发酵设备及消毒灭菌专家讲座第5页发酵辅助设备无菌空气系统无菌空气要求灭菌系统、管道、阀门6发酵设备及消毒灭菌专家讲座第6页培养基及其灭菌培养基（medium）培养基成份碳源、氮源、无机盐、前体物、促进剂、抑制剂7发酵设备及消毒灭菌专家讲座第7页培养基类型按组成按状态按用途8发酵设备及消毒灭菌专家讲座第8页培养基灭菌空罐灭菌实罐灭菌连续灭菌：高温短时9发酵设备及消毒灭菌专家讲座第9页第四节发酵工程制药

过程与控制10发酵设备及消毒灭菌专家讲座第10页种子扩大培养11发酵设备及消毒灭菌专家讲座第11页微生物发酵方式分批发酵补料分批发酵半连续发酵连续发酵12发酵设备及消毒灭菌专家讲座第12页13发酵设备及消毒灭菌专家讲座第13页发酵过程中中间分析项目产物产量pH糖氨基氮菌丝形态14发酵设备及消毒灭菌专家讲座第14页发酵过程影响原因及控制菌体浓度营养物质温度pH溶氧泡沫染菌发酵终点判断15发酵设备及消毒灭菌专家讲座第15页菌体浓度在适合生长速率下，发酵产物产率与菌体浓度成正比关系。尤其是初级代谢产物。菌体浓度过低，产物产率下降。菌体浓度过高，产生其它影响。办法：调整培养基中营养物质浓度。16发酵设备及消毒灭菌专家讲座第16页营养物质碳源氮源磷酸盐：生长亚适量浓度补料：半饥饿状态17发酵设备及消毒灭菌专家讲座第17页温度考虑菌种及生长阶段综合考虑其它培养条件考虑菌种生长情况发酵热18发酵设备及消毒灭菌专家讲座第18页pH补加酸或碱和补料方式19发酵设备及消毒灭菌专家讲座第19页溶氧和CO2溶氧异常下降溶氧异常上升办法20发酵设备及消毒灭菌专家讲座第20页泡沫负面影响办法21发酵设备及消毒灭菌专家讲座第21页染菌发酵前期染菌发酵后期染菌22发酵设备及消毒灭菌专家讲座第22页发酵终点判断提升产物产量和经济效益降低生产成本主要指标与中间分析项目雷同23发酵设备及消毒灭菌专家讲座第23页第五节发酵工业中

代谢调控24发酵设备及消毒灭菌专家讲座第24页代谢调控利用人为方法对微生物代谢调整系统进行遗传改造和条件控制，在确保微生物适当生长条件下，建立新代谢方式，以期按照人们意志有目标地过量积累所需代谢产物，提升生产效率。25发酵设备及消毒灭菌专家讲座第25页初级代谢能使营养物质转变成机体结构物质和对机体含有生理活性作用物质，或是为机体生长提供能量一类代谢。26发酵设备及消毒灭菌专家讲座第26页次级代谢存在于一些生物中（如一些植物和微生物），并在一定生长久内出现一类代谢。在抵抗恶劣环境、伪装躲避、去除本身毒素和排泄物时很主要。27发酵设备及消毒灭菌专家讲座第27页微生物初级代谢与次级代谢关系多糖、蛋白质、脂肪、无机盐初级代谢中间产物（单糖、氨基酸、核苷酸、脂肪酸）蛋白质、核酸、粘多糖、脂多糖等生物大分子分解合成分解代谢生物合成生长抗生素、生物碱、色素、毒素等次级代谢产物28发酵设备及消毒灭菌专家讲座第28页代谢产物合成调控初级代谢对次级代谢调整碳代谢物调整氮代谢物调整磷酸盐调整ATP调整诱导物调整末端产物反馈调整细胞膜通透性调整其它：金属离子、溶解氧等调整29发酵设备及消毒灭菌专家讲座第29页初级代谢对次级代谢调整次级代谢产物以初级代谢产物为母体衍生而来。次级代谢产物合成反应酶由初级代谢路径酶演化而来。所以，初级代谢终产物过量往往会抑制次级代谢产物合成。30发酵设备及消毒灭菌专家讲座第30页碳代谢物调整葡萄糖效应解除方法变更速效碳源和迟效碳源配比；流加葡萄糖。31发酵设备及消毒灭菌专家讲座第31页氮代谢物调整分解代谢物阻遏效应解除方法变更速效氮源和迟效氮源配比；流加无机氮。32发酵设备及消毒灭菌专家讲座第32页磷酸盐调整磷酸盐效应：类似于葡萄糖效应机制：促进初级代谢、抑制次级代谢抑制次级代谢产物前体形成阻遏一些关键酶合成抑制一些关键酶活性增加菌体能荷状态33发酵设备及消毒灭菌专家讲座第33页ATP调整直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中一些酶活性。如四环素合成。34发酵设备及消毒灭菌专家讲座第34页诱导物调整一些参加次级代谢产物合成酶为诱导酶。需有诱导物存在，诱导酶才能形成。如甲硫氨酸诱导头孢菌素C。35发酵设备及消毒灭菌专家讲座第35页末端产物反馈调整末端产物抑制合成路径中第一个酶活性，从而降低产物合成代谢能力。原位产物分离偶联技术（insituproductremoval，ISPR）36发酵设备及消毒灭菌专家讲座第36页细胞膜通透性调整利于代谢产物分泌到胞外，降低胞内浓度，从而防止末端产物反馈调整。如：谷氨酸生产，采取控制生物素浓度、添加青霉素、添加吐温80等表面活性剂、选育油酸缺点型菌株等方法。37发酵设备及消毒灭菌专家讲座第37页抗生素发酵生产38发酵设备及消毒灭菌专家讲座第38页抗生素定义生物在其生产活动过程中所产生，并能在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其它微生物或肿瘤细胞有机物。39发酵设备及消毒灭菌专家讲座第39页发展历史1929年，英国弗莱明发觉青霉素。二战期间，大规模发酵生产，世界上最早用于临床抗生素。20世纪60-70年代，利用生物合成和半合成方法研制抗生素衍生物。20世纪80年代至今，依据作用机理理性筛选阶段，包含耐药筛选模型等。40发酵设备及消毒灭菌专家讲座第40页抗生素分类依据抗生素生物起源分依据抗生素作用对象分依据抗生素作用机制分依据抗生素化学结构分41发酵设备及消毒灭菌专家讲座第41页依据抗生素生物起源分放线菌产生抗生素：链霉素、四环素、红霉素真菌产生抗生素：青霉素、头孢菌素细菌菌产生抗生素：多粘菌素、杆菌肽42发酵设备及消毒灭菌专家讲座第42页依据抗生素作用对象分抗G+抗生素：青霉素、红霉素抗G-抗生素：链霉素、多粘菌素广谱抗生素：氨苄青霉素抗真菌抗生素：两性霉素抗病毒和噬菌体抗生素：氯霉素、艾霉素抗原虫抗生素：灭滴虫素抗癌抗生素：阿霉素、博莱霉素43发酵设备及消毒灭菌专家讲座第43页依据抗生素作用机制分抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素抑制细胞膜功效：多粘菌素干扰蛋白质合成：四环素抑制核酸合成：博莱霉素、利福霉素抑制生物能作用：抗霉素44发酵设备及消毒灭菌专家讲座第44页依据抗生素化学结构分β-内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素大环内酯类：红霉素、麦迪加霉素四环类：四环素、土霉素多肽类：多粘菌素45发酵设备及消毒灭菌专家讲座第45页

HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-内酰胺环RnaturalpenicillinR=CH2-CO-β-内酰胺类抗生素结构特征46发酵设备及消毒灭菌专家讲座第46页氨苄青霉素甲氧苯青霉素羧苄青霉素苯唑西林47发酵设备及消毒灭菌专家讲座第47页大环内酯类和四环类抗生素结构特征48发酵设备及消毒灭菌专家讲座第48页β-内酰胺类抗生素生物合成L-α-氨基己二酸+L-半胱氨酸+L-缬氨酸ACV三肽ACV合成酶异青霉素N(IPN)异青霉素合成酶6-APA青霉素N，…青霉素G头孢菌素C49发酵设备及消毒灭菌专家讲座第49页β-内酰胺类抗生素代谢调控碳源分解代谢物阻遏赖氨酸反馈调整：共同中间体L-甲硫氨酸对头孢菌素C诱导作用头孢菌素C扩环/羟化双功效酶需Fe2+，分子氧等辅助因子缬氨酸是青霉素生物合成前体50发酵设备及消毒灭菌专家讲座第50页青霉素发酵生产工艺流程51发酵设备及消毒灭菌专家讲座第51页工艺控制关键点生产种子制备丝状菌生产种子是由保藏在低温冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小（大）米固体培养基上，25℃培养7天，真空干燥并以这种形式保留备用。生产时按10%接种量移种到含有葡萄糖、玉米浆、尿素为主种子罐内，26℃培养至菌丝浓度达6-8%，菌丝形态正常，按10-15%接种量移入含有花生饼粉、葡萄糖为主二级种子罐内，27℃培养至菌丝浓度10-12%，形态正常，即可作为发酵种子。52发酵设备及消毒灭菌专家讲座第52页培养基成份控制碳源产黄青霉菌可利用碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖等。当前生产上普遍采取是淀粉水解液、糖化液为碳源，进行连续流加方式。53发酵设备及消毒灭菌专家讲座第53页氮源氮源常选取玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。54发酵设备及消毒灭菌专家讲座第54页前体生物合成含有苄基基团青霉素G，需在发酵液中加入前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺，一次加入量小于0.1%，并采取屡次加入，以预防前体对青霉素毒害。55发酵设备及消毒灭菌专家讲座第55页无机盐加入无机盐包含硫、磷、钙、镁、钾等,且用量要适度。另外，因为铁离子对青霉菌有毒害作用,必须严格控制铁离子浓度，普通控制在30μg/ml。56发酵设备及消毒灭菌专家讲座第56页发酵培养控制加糖控制加糖量控制是依据残糖量及发酵过程中pH值确定。最好是依据排气中CO2量及O2量来控制，普通在残糖降至0.6%左右，pH值上升时开始加糖。加糖率：0.07-0.15%，每2h一次或连续流加。57发酵设备及消毒灭菌专家讲座第57页补氮及加前体补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素。发酵60-70开始补加，使发酵液氨基氮控制在0.01%-0.05%。发酵8-12h后补前体，以使发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.05%-0.08%。58发酵设备及消毒灭菌专家讲座第58页pH值控制普通为pH6.5-6.9，尽可能防止超出pH7.0。pH上升能够补加葡萄糖或天然油脂来控制；pH下降则提升通气量，或补加氨水和碳酸钙来控制。当前生产上趋于采取直接加酸或加碱自动控制pH。59发酵设备及消毒灭菌专家讲座第59页温度控制前期25-26℃，后期23℃，以降低后期发酵液中青霉素降解破坏。60发酵设备及消毒灭菌专家讲座第60页溶解氧和搅拌速率控制普通要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧30%。通风比普通为1:0.8vvm。搅拌转速在发酵各阶段应依据需要而调整。61发酵设备及消毒灭菌专家讲座第61页泡沫控制在发酵过程中产生大量泡沫，能够用天然油脂，如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂“泡敌”来消泡，应该控制其用量并要少许屡次加入，尤其在发酵前期不宜多用，不然会影响菌体呼吸代谢。62发酵设备及消毒灭菌专家讲座第62页发酵液质量控制生产上按要求时间从发酵罐中取样，用显微镜观察菌丝形态改变来控制发酵。生产上惯称“镜检”，依据“镜检”中菌丝形改变和代谢改变其它指标调整发酵温度，经过追加糖或补加前体等各种办法来延长发酵时间，以取得最多青霉素。63发酵设备及消毒灭菌专家讲座第63页青霉素提取纯化工艺64发酵设备及消毒灭菌专家讲座第64页发酵液过滤和预处理低温过滤：鼓式过滤或板框过滤杂蛋白去除：硫酸调pH4.5-5.0，0.07%絮凝剂PPB和0.07%硅藻土二次过滤。65发酵设备及消毒灭菌专家讲座第65页萃取乙酸丁酯（BA）二次萃取法一次萃取：pH1.8-2.2，浓缩倍数1.5-2.0。反萃取：pH6.8-7.2，浓缩倍数3-4。二次萃取