使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产精细化学药品的方法

使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产精细化学药品的方法专利名称：使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产精细化学药品的方法使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物生产精细化学药品的方法本发明涉及利用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物来生产精细化学药品的方法。所述精细化学药品可以是氨基酸、用于聚合物合成的单体、糖、脂类、油类、脂肪酸或维生素，且优选是天冬氨酸家族的氨基酸，特别是甲硫氨酸或赖氨酸，或所述氨基酸的衍生物，特别是尸胺。另外，本发明涉及重组微生物，所述重组微生物与原始微生物相比具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性，以及涉及这些微生物在例如天冬氨酸家族氨基酸及其衍生物等精细化学药品生产中的用途。背景技术：精细化学药品，例如包括如乳酸等有机酸，如二氨基戊烷(尸胺)等有机胺，标准(proteogenic)或非标准氨基酸，碳水化合物，芳香化合物，如吡啶二羧酸(dipicolinate)的芳香杂环化合物、维生素和辅因子，饱和与不饱和脂肪酸，通常在制药、农业、化妆品以及食品和饲料工业中需要并使用，但也作为单体用于聚合物合成。它们通常通过化学过程进行生产，但也有越来越多的精细化学药品通过发酵过程进行生产。关于例如氨基酸甲硫氨酸，目前世界年产量达约500，000吨。标准的工业生产方法不是发酵，而是多步骤的化学过程。甲硫氨酸是禽畜饲料中的第一限制性氨基酸，并因此主要用作饲料添加剂。现有技术中已发表了多种尝试，通过发酵(例如使用大肠杆菌等微生物)来生产甲硫氨酸。如谷氨酸、赖氨酸和苏氨酸等其他氨基酸，是通过例如发酵方法来生产的。对于这些目的，已经证明如谷氨酸棒杆菌(C.glutamic·)等特定微生物特别合适。通过发酵进行氨基酸生产有特殊的优势，即只生产L-氨基酸，并且避免使用如溶剂等通常用于化学合成的造成环境问题的化学品。关于如吡啶二羧酸、尸胺或赖氨酸等精细化学药品，所述化合物应用于多种领域，并且通常通过非发酵的方法生产。二吡啶羧酸(CAS号499-83-2)，也称为吡啶-2，6-二羧酸或DPA，应用于不同的技术领域，例如用作聚酯或聚酰胺型共聚物合成中的单体，吡啶合成的前体，过氧化物和过酸(例如叔丁基过氧化物、二甲基-环己酮过氧化物、过氧乙酸和过氧单硫酸(peroxy-monosulphuricacid))的稳定剂，金属表面抛光液的成分，由于存在痕量金属离子容易变质(螯合效应sequestratingeffect)的有机材料的稳定剂，环氧树脂稳定剂，以及摄影用溶液或乳剂的稳定剂(防止钙盐沉淀)。众所周知，DPA是在细菌的内生孢子中生物合成的。催化从二氢吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)生物合成DPA的酶是吡啶二羧酸合成酶。所述酶已从枯草芽孢杆菌中分离出来并进一步表征。它由spoVP操纵子(BG10781，BG10782)编码。在1950年代，在链霉菌属产生的几种强碱性肽抗生素中鉴定出L-β-赖氨酸。水解时产生L-β-赖氨酸的抗生素包括紫霉素、黄链霉菌素Α、链丝菌素、玫瑰丝菌素和土霉素(Stadtman，Adv.Enzymol.Relat.AreasMolec.Biol.38:413(1973))。β-赖氨酸也是诺卡尔菌属真菌产生的抗生素(如菌霉素)的组分，并且赖氨酸可用于制备其他生物学上有活性的化合物。然而，赖氨酸的化学合成既费时，需要昂贵的起始材料，又通常得到外消旋混合物。1，5-二氨基戊烷是目前通过L-赖氨酸的化学过程(脱羧)生产的相对昂贵的特制化学品。通过发酵生产的二氨基戊烷在市场上还未能得到。当今精细化学药品的发酵生产通常在如谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)>；^J木干胃、酉良胃##(Saccharomycescerevisiae)>^M##(Schizosaccharomycespombe)、毕赤式酵母(Pichiapastoris)、黑曲霉(Aspergillusniger)、枯草芽孢杆菌、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)或氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)等微生物中进行。特别地，已知谷氨酸棒杆菌具有产生大量氨基酸(如L-谷氨酸和L-赖氨酸)的能力(Kinoshita，S.(1985)Glutamicacidbacteria；页115-142,于A.L.DemainandN.A.Solomon(编),Biologyofindustrialmicroorganisms,Bejamin/CummingsPublishingCo.,London)。现有技术的一些尝试，在如大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌等微生物中生产如氨基酸、脂类、维生素或碳水化合物等精细化学药品，是设法通过例如增强各精细化学药品生物合成途径有关基因的表达，来达到该目的的。如果，例如已知氨基酸(如甲硫氨酸或赖氨酸)的生物合成途径中某个步骤是限制速率的，各自酶的过度表达可能容许得到产生更多催化反应产物的微生物，并且因此将最终导致相应氨基酸的产量提高。相似地，例如在想得到的氨基酸生物合成途径中，如果已知由于向不期望的中间产物合成传递大量代谢能，而不期望发生某个酶促步骤，可以考虑下调相关酶活性的表达，以便只利于最终导致所需氨基酸合成的那些代谢反应。例如在WO02/10209、WO2006/008097和WO2005/059093中，描述了通过甲硫氨酸或赖氨酸的生物合成中相关基因的表达上调和/或下调，来增加例如甲硫氨酸或赖氨酸的产量的尝试。例如在WO2007/113127、WO2007/101867和EP08151031.5中，描述了通过如尸胺、吡啶二羧酸或赖氨酸等精细化学药品生物前体的生物合成中相关基因表达的上调和/或下调，来增加所述化合物的产量的尝试。异柠檬酸脱氢酶(ICD，有时也称IDH,EC1.1.1.42，SEQIDNO3)是参与如谷氨酸棒杆菌的柠檬酸循环(TCA)的酶。它催化循环中的第三步异柠檬酸的氧化脱羧，产生α酮戊二酸和CO2。Eikmanns等人鉴定、克隆并表征了谷氨酸棒杆菌中编码I⑶的基因(Eikmarms，B.等人，J.Bacteriol.(1995)177:774-782)。通过在谷氨酸棒杆菌中敲除来使编码I⑶的染色体icd基因失活，会导致谷氨酸营养缺陷(Eikmarms，B.等人，J.Bacteriol.(1995)177:774-782)。谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中的I⑶过度表达并不提高谷氨酸产量(Eikmarms，B.等人，J.Bacteriol.(1995)177:774-782)。然而，在DE10210967中已有报道，大肠杆菌中ICD的过度表达导致苏氨酸产量增加。在谷氨酸棒杆菌中的icd和编码谷氨酸脱氢酶的基因进行共表达，则报道了与之矛盾的结果=Eikmarms没有记录任何效果，JP63214189和JP2520895报道了谷氨酸产量提高。尽管考虑到已报道的增加精细化学药品(如天冬氨酸家族氨基酸、其生化前体及其衍生物)产量的尝试，仍然需要备选生产方法。发明目标及概要本发明的目标之一是提供使用具有至今未知特性的如谷氨酸棒杆菌等工业上重要的微生物，来生产精细化学药品的备选的发酵方法，以及所述方法中使用的微生物。如从本发明后续描述中逐渐明显所示，本发明如独立的权利要求所述解决这些和其他目标。从属的权利要求涉及优选的实施方案。在一个实施方案中，本发明涉及使用具有降低的异柠檬酸脱氢酶活性的细胞来生产精细化学药品的方法。目前未知所述酶的下调会否导致特定生化产物的产量提高，特别是天冬氨酸下游产物的产量提高。根据本发明的方法生产的精细化学药品优选通过从天冬氨酸到甲硫氨酸和/或赖氨酸的生物合成途径的中间体来进行合成。精细化学药品优选天然存在的氨基酸，例如赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸，或其含氮衍生物，例如β-赖氨酸、吡啶二羧酸和1，5-二氨基戊烷。生产方法中使用的细胞可以是原核生物的、低等真核生物的、分离的植物细胞、酵母细胞、分离的昆虫细胞或分离的哺乳动物细胞，特别是细胞培养系统中的细胞。在本发明背景下，术语“微生物”用于所述种类的细胞。在本发明中表现出降低的ICD活性的优选的微生物种类是ICD表达降低的棒杆菌，并特别优选ICD表达降低的谷氨酸棒杆菌。具有降低的I⑶活性，并优选包含导致在宿主细胞中I⑶所述表达降低的经修饰的核苷酸序列的重组微生物，也是本发明的一部分。这样的微生物可以是谷氨酸棒杆菌。本发明也涉及前述重组微生物用于生产精细化学药品的用途，特别是通过从天冬氨酸到甲硫氨酸和/或赖氨酸的生物合成途径的中间体进行生产的用途。特别地，它可用于如赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸等天然存在氨基酸的生产。它也可以特别用于如β-赖氨酸、吡啶二羧酸和1，5-二氨基戊烷等含氮精细化学药品的生产。特别地，提供了本发明的以下实施方案生产精细化学药品的方法，其利用与相应原始微生物相比，具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性的微生物；与相应原始微生物相比，具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性的重组微生物，条件是ICD表达的降低并不是由于经修饰的编码ICD的核苷酸序列(icd序列)代替微生物的天然icd序列进行表达，该表达中所述经修饰的icd编码序列源自未修饰的icd序列，以致未修饰核苷酸序列的至少一个密码子在经修饰的icd序列中被比较不频繁使用的密码子(依据宿主细胞密码子使用)所替换；根据实施方案(2)用于生产精细化学药品的微生物的用途；和从根据实施方案(1)的方法得到的精细化学药品制备如聚合物等化学药品和化学终产物的方法，其包括根据实施方案(1)的方法生产所述精细化学药品，作为一个步骤。图1从赖氨酸生物合成中分支的酶促反应中，发酵制备β-赖氨酸、吡啶二羧酸和1，5_二氨基戊烷。所示的酶与发酵中使用的微生物通常是异源的。序列表，自由文本SEQIDNO:描述1编码SEDIDNO:3中ICD的野生型谷氛酸棒杆菌DNA2包括/o/基因上游和下游500个核苷酸天然DNA序列的谷氨酸棒杆菌icd权利要求1.生产精细化学药品的方法，使用与相应的初始微生物相比，具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物。2.权利要求1的方法，其中具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性的微生物是重组微生物。3.权利要求1或2的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性降低是由于异柠檬酸脱氢酶表达的部分或完全降低。4.权利要求3的方法，其中异柠檬酸脱氢酶活性的部分或完全降低是由于作为异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的起始密码子的ATG被取代，优选的用GTG取代ATG。5.根据权利要求1-4的任一项的方法，其中微生物是谷氨酸棒杆菌，优选的谷氨酸棒杆菌ATCClSOSZjTCClSOSZlysC"或ATCC13^6，或任一上述菌株的衍生物，优选LUl1424。6.根据权利要求5的方法，其中微生物是LU11424，它的部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性是由于作为异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的起始密码子的ATG被取代，优选的用GTG取代ATG。7.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中作为中间产物或终产物生产的是选自天冬氨酸家族的氨基酸及其生物化学前体的化合物。8.权利要求7的方法，其中所述化合物是中间产物，然后酶促或非酶促转化为有机胺、有机酸或氨基酸。9.权利要求8的方法，其中所述中间产物是赖氨酸、或其在天冬氨酸下游的生物化学前体之一，其中终产物优选的是所述中间产物的非天然衍生物。10.权利要求7-9的任一项的方法，其中微生物包括至少一种异源的酶，所述酶催化在中间产物向终产物的后续转化中的反应步骤。11.权利要求10的方法，其中异源的酶选自催化精细化学药品生物合成中一步或多步的酶，优选的是从赖氨酸或其天冬氨酸下游的生物化学前体合成的精细化学药品。12.权利要求11的方法，其中异源的酶选自赖氨酸脱羧酶、赖氨酸-2，3-氨基变位酶和吡啶二羧酸合成酶。13.根据权利要求1-12的任一项的方法，其中所述精细化学药品选自(i)天冬氨酸家族的氨基酸；()其在天冬氨酸下游的生物化学通路中的生物化学前体；(iii)所述氨基酸(i)和前体(ii)的衍生物。14.权利要求13的方法，其中所述精细化学药品选自赖氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、二氨基戊烷、β-赖氨酸和吡啶二羧酸。15.根据权利要求1-14的任一项的方法，附加条件是当精细化学药品选自赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸时，异柠檬酸脱氢酶表达的降低不是由于修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的表达取代了微生物的天然的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，其中，所述修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列源自未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，使得根据微生物的密码子使用，在修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列中，未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的至少一个密码子被较不频繁使用的密码子取代。16.权利要求14或15的方法，其中精细化学药品是选自1，5-二氨基戊烷、β-赖氨酸和吡啶二羧酸的化合物。17.权利要求16的方法，其中生产1，5_二氨基戊烷。18.权利要求17的方法，其中重组微生物包括异源的赖氨酸脱羧酶。19.权利要求17或18的方法，其中重组微生物中的二氨基乙酰转移酶下调或者失活。20.权利要求16的方法，其中生产β-赖氨酸。21.权利要求20的方法，其中重组微生物包括异源的赖氨酸_2，3-氨基变位酶。22.权利要求16的方法，其中生产吡啶二羧酸。23.权利要求22的方法，其中重组微生物包括异源的吡啶二羧酸合成酶。24.根据权利要求1-6的任一项的方法，其中海藻糖作为中间产物或终产物生产。25.与相应的初始微生物相比，具有部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性的重组微生物，附有条件是异柠檬酸脱氢酶表达的降低不是由于修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的表达取代了微生物的天然的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，其中，所述修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列源自未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列，使得根据宿主细胞的密码子使用，在修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列中，未修饰的异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的至少一个密码子被较不频繁使用的密码子取代。26.权利要求25的重组微生物，其中微生物是谷氨酸棒杆菌，优选的谷氨酸棒杆菌ATCC13032、ATCC130321ysCfto或ATCC13^6，或任一上述菌株的衍生物，优选LUl1424。27.权利要求沈的重组微生物，其中LU11424的部分或完全降低的异柠檬酸脱氢酶活性是由于作为异柠檬酸脱氢酶编码核苷酸序列的起始密码子的ATG被取代，优选的用GTG取代ATG。28.根据权利要求25-27的任一项的重组微生物，其还包括异源的酶，所述酶能够将天冬氨酸家族的氨基酸或其生物化学前体之一转化为其它精细化学药品，优选的能够将赖氨酸或其在天冬氨酸下游的生物化学前体转化为其它精细化学药品。29.根据权利要求25-28的任一项的重组微生物，其中异源的酶选自赖氨酸脱羧酶、赖氨酸_2，3-氨基变位酶和吡啶二羧酸合成酶。30.权利要求四的重组微生物，其中异源的酶是亮氨酸脱羧酶，其中重组微生物中的二氨基乙酰转移酶是下调的或失活的，且能够将赖氨酸转化为1，5-二氨基戊烷。31.根据权利要求25-30的任一项的重组微生物，其适合