药物分析 第十五章甾体激素类药物的分析

第十五章甾体激素类药物的分析甾体激素类药物的分析甾体激素类药物环戊烷并多氢菲母核的激素类药物发现史SteriodHormones2甾体激素类药物的分析1.甾体激素是在研究哺乳动物内分泌系统时发现的内源性物质发现史2.1932年至1939年间，从腺体中获得雌酮(1932)、雌二醇(1932)、睾酮(1935年)及皮质酮(1939)等的纯品结晶。3.随后，发明用薯蓣皂甙(Diosgenin)为原料进行半合成生产甾体药物，使生产规模扩大，成本降低4.发现肾上腺皮质激素治疗风湿性关节炎及其在免疫调节上的重要价值，使甾体药物成为医院中不可缺少的药物5.甾体口服避孕药的研究成功，使人类生育控制达到了新水平3甾体激素肾上腺皮质激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素分类4Contents结构与分类1鉴别2检查3含量测定45第一节基本结构与性质母体结构6第一节基本结构与性质母体衍生结构7第一节基本结构与性质一、肾上腺皮质激素311172021氢化可的松(hydrocortisone)醋酸地塞米松(dexamethasoneacetate)16α-甲基21-酯化17α-羟基9α-氟3-酮1,2-双键11β-羟基20-酮89本类药物结构特征A环Δ4-3-酮基,为共轭体系,在波长240nm附近有紫外吸收,部分药物在C1-C2之间有双键,也有紫外吸收10本类药物结构特征C17位上为α-醇酮基,具有还原性.多数药物有C17-α-羟基,部分药物α-醇羟基与酸成酯.11本类药物结构特征部分药物的C6或C9位由卤素取代,呈相应的卤化物反应12本类药物结构特征部分药物C11位上有羟基或酮基取代13二、雄性激素及蛋白同化激素第一节基本结构与性质甲睾酮(methyltestosterone)丙酸睾酮(testosteronepropionate)苯丙酸诺龙(nandrolonephenylpropionate)17β-羟基14甲睾酮(methyltestosterone)A环Δ4-3-酮基C17位上为羟基,部分药物的羟基被酯化雄性激素上的母核为19个碳原子,蛋白同化激素在C10位上一般无角甲基,母核只有18个碳原子15第一节基本结构与性质三、孕激素黄体酮(progesterone)醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)米非司酮(mifepristone)16第一节基本结构与性质四、孕激素炔诺酮(norethisterone)左炔诺孕酮17第一节基本结构与性质三、孕激素黄体酮(progesterone)A环Δ4-3-酮基C17位上有甲酮基或乙炔基.多数在C17位上羟基部分药物的羟基被酯化18第一节基本结构与性质四、雌性激素19第一节基本结构与性质四、雌性激素有些药物在C17位上有乙炔基,构成19-去甲孕甾烷母核A环为苯环,C3位上有酚羟基,有的药物C3位上的酚羟基成酯C17位上有羟基有些药物C17位羟基成酯.20第一节基本结构与性质总结如下21第二节Identification

物理常数的测定化学鉴别法制备衍生物测定熔点

UVIRTLCHPLC理化性质与鉴别试验22第二节Identification一、物理常数的测定1.熔点炔雌醇m.p.201℃黄体酮双肟m.p.238℃23苯丙酸诺龙缩氨基脲m.p.178~185℃分解丙酸睾丸素m.p.150~156℃第二节Identification24第二节Identification二、化学鉴别法2.比旋度3.吸收系数与强酸的呈色反应官能团的反应1.与强酸的呈色反应甾体激素类药物硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸呈色25第二节Identification2.官能团的反应①C17-α-醇酮基——还原性A.呈色反应C17-α-醇酮基四氮唑盐OH-呈色B.沉淀反应C17-α-醇酮基氨制硝酸银银镜反应C17-α-醇酮基碱性酒石酸铜Cu2O↓26第二节Identification②C3–酮基和C20–酮基甾酮类2,4-二硝基苯肼呈色异烟肼、硫酸苯肼异烟腙（黄色）睾酮异烟双腙（黄色）黄体酮27③甲酮基或活泼亚甲基第二节Identification亚硝基铁氰化钠间二硝基酚/芳香醛呈色蓝紫色黄体酮④卤素⑤酚羟基雌激素类重氮苯磺酸红色偶氮染料28⑥乙炔基第二节Identification↓炔雌醇白⑦酯基29黄体酮三、UV四、IR第二节Identification酚羟基醇羟基炔键羰基苯环骨架振动30第二节Identification五、TLC

制剂分析对照品法炔诺酮六、HPLC31第三节PurityTest一、TLC地塞米松磷酸钠中杂质检查32第三节PurityTest氢化可的松中其他甾体检查对照品60μg/ml供试品3.0mg/mlCHCl3-MeOH(9:1)溶剂硅胶GF254二氯甲烷-乙醚-甲醇-水

385:60:15:2展开后晾干105℃干燥10min碱性四氮唑蓝显色33对照溶液——0.02mg/ml供试液——1mg/ml二、HPLC第三节PurityTest黄体酮中有关物质检查供试品溶液的杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于对照液的主峰面积的3/434第三节PurityTest三、硒的检查来源

合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢四、溶剂残留甲醇和丙酮(GC)0.3%0.5%35第三节PurityTest五、游离磷酸盐检查钼酸铵磷钼酸740nm，UV36第四节Assay

HPLC

UV

比色法

非水溶液滴定法四氮唑比色法异烟肼比色法柯柏反应比色法37第四节Assay一、HPLC对照液供试液己烯雌酚黄体酮38第四节Assay二、UV醋酸地塞米松39第四节Assay三、比色法

肾上腺皮质激素类OH-[还原]2,3,5-TriphenyltatrazoliumchlorideTTC(RedtatrazolineRT)甲潜(Formazan)深红色

λmax480~490nm40第四节AssayBluetetrazolineBTBT-单甲潜BT-双甲潜蓝色

λmax525nm41氢化可的松软膏的含量测定第四节Assay精密量取对照品溶液及供试品溶液各1ml，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9ml与氯化三苯四氮唑试液1ml，摇匀，各再精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25℃的暗处放置40min～45min，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得影响因素基团溶剂与水分碱空气中氧与光线温度与时间42第四节Assay（1）基团对反应速度的影响C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯C16无论何种取代基ν↓（2）溶剂、水分的影响含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10%含水30%→几无反应—

无水乙醇(无醛)43第四节Assay（3）O2与光线的影响（4）碱的种类及加入顺序反应应在强碱性（pH13.75）条件下进行以氢氧化四甲基铵的结果最佳（5）温度与时间t℃↑→ν↑→甲瓒分解↑→%↓44(二)异烟肼法(Isonicotinicacidhydrazide)第四节AssayINH△4-3-酮IsonicotinicacidHydrazide45第四节Assay影响因素（1）反应速度C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反应专属性强（2）溶剂的选择异烟肼盐酸盐→甲醇、乙醇无水（3）水分、O2与光线的影响含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓不挥发溶剂、不吸收水分时→O2与光线无影响46第四节Assay(4)酸、异烟肼的量盐酸:异烟肼=2:1酸度↑→异烟肼盐↓酸度↓→A↓样品:异烟肼=1:8→ν↑

(5)温度t℃↑→ν↑47第四节Assay(三)Kober反应比色法48第二步反应515465450500550nmAKober反应吸收光谱第一步反应第四节Assay采用本法测定炔雌醇片及复方炔诺酮片、复方炔诺孕酮滴丸、复方左炔诺孕酮片中的炔雌醇的含量49第四节Assay四、非水滴定——米非司酮五、生物样品中的甾体激素的分析Dopingcontrol滥用药物检测刺激剂麻醉剂β-阻断剂利尿剂遮蔽剂合成类固醇及β2激动剂肽类激素外源性内源性50兴奋剂检测特点色谱方法是理想的检测手段。1976年使用气相色谱-质谱联用手段检测甾体，1980年开始用毛细管气相色谱法检测，至1984年大体基本定型。药物及其代谢物的种类多，变化大，禁用的百余种药物以原体或一个或多个代谢产物的形式存在与人体体液中，因此，需要检测和确证的化合物多达几百种。除此以外，用药后的不同时间，这些化合物的浓度不断的发生变化，直到排出体外。药物在人体体液中的浓度很低，药物在人体体液中的浓度常常是ng级或更低的水平，因此对检测的灵敏度要求很高。要求准确的定性和定量，不能有丝毫的疏漏和差错。检测者要对每一种药的药物代谢动力学及光谱分析有全面娴熟的了解及足够的分析参考资料51检测基质1.尿液尿样检测是兴奋剂检测的理想样本。其优点在于：取样方便；对人无损害；尿液中的药物浓度高于血液中的药物浓度；尿液中的其他干扰少。2.血样补充尿样分析方法的不足，目前尚处于研究探索阶段，目前仅用于血液回输，红细胞生成素，生长激素，绒毛膜促性腺激素，睾酮等的测量。523.头发在法医，毒性分析中已有较长历史，但在兴奋剂研究中是才兴起研究方向。有采样容易，无损伤，不易作弊的特点，备受关注。皮质类固醇在体内消除很快，如果赛前停药，尿液分析就检测不到，而发样分析仍可检出。4.体液53检测步骤一、筛选方法（1）挥发性含氮化合物组：主要检测刺激剂。这类药物多以游离形式排出。（2）难挥发含氮化合物组：主要检测麻醉阵痛剂和β-阻断剂。这两类药物多以结合形式排出，因此需先水解，使之游离，再进行衍生化后检测。（3）利尿剂组：药物经提取后用高效液相色谱法分析检测，此组同时检测2种兴奋剂、咖啡因和匹莫林。（4）甾体同化激素组：此类药物有的以游离形式，有的以结合形式排出，我们所用的方法为同时检测。54二、确证方法经筛选判为阳性的尿样，需进一步加以确证，根据规定，确证结果须给出药物或其代谢物的质谱图，因此在确证方法中均使用气相色谱法-质谱联用仪，确证时的分组同筛选方法中所述。（1）挥发性含氮化合物组方法同筛选，最后之提取物浓缩后进样于GC/MSD。（2）难挥发含氮化合物组方法同筛选，最后之衍生化产物取小量进样于GC/MSD。（3）利尿剂组此组药物需衍生化，然后进样于GC/MS（4）甾体同化激素组方法同筛选，唯最后得出全质谱图作为确证。检测步骤55中国兴奋剂检测中心座落在北京国际奥林匹克体育中心内,自1989年得到国际反兴奋剂机构(WADA)的承认后，连续15年通过资格考试。该中心掌握了目前最先进的检测技术，包括高分辩率质谱、同位素质谱、EPO血检、尿检等方法，同时承担WADA赛外检测任务和周边国家的抽样检测任务，检测数量达到每年8000份.56谢谢！合成类固醇及β2激动剂

共27种。合成类固醇又称为甾体同化激素，是雄性激素衍生物。这类药物有增长肌肉的作用，为很多运动员口服或注射使用，但副作用也