蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种

蔬菜品质基因工程

调控抗坏血酸合成代谢基因提高维生素C含量1蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024超量表达GMP基因提高番茄果实抗坏血酸含量GMP果实VC含量ZhangCJetal.,2011;20132蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024超量表达MIOX基因提高番茄果实抗坏血酸含量果实VC含量Unpublisheddata3蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024超量表达GalUR基因提高番茄果实抗坏血酸含量Unpublisheddata4蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024抑制APX表达，提高番茄果实抗坏血酸含量抗坏血酸含量APX酶活性ZhangYYetal.,20115蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024RNAi抑制AO酶活性，提高果实抗坏血酸积累抗坏血酸含量AO酶活性ZhangYYetal.,20116蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024通过基因工程延长蔬菜贮藏期目前主要通过两种途径来延长蔬菜存贮期通过抑制多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性来抑制细胞壁果胶的降解，使果实抗软化通过抑制乙烯生成，提高果实耐受“成熟过度”的能力7蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024反义抑制聚半乳糖醛酸酶，减少果实细胞壁降解，提高番茄耐贮性8蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024反义抑制ACO基因，减少乙烯释放量，提高番茄果实耐贮性将反义ACO基因导入番茄，抑制果实中乙烯释放，获得迟熟转基因番茄，再结合杂种优势育种，培育成一代杂种——“华番1号”。1997年通过农业部基因工程安全委员会审批，1998通过品种审定，成为我国第1个获得农业部批准上市的转基因植物品种。9蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024转基因蔬菜现状转基因蔬菜研究进展迅速，促进基础研究生物安全性顾虑导致转基因应用研究进展偏慢利用生物技术和分子生物学手段，尝试非转基因途径，用于蔬菜遗传改良10蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024二.蔬菜分子标记辅助育种标记开发连锁标记基因标记（功能标记）分子标记辅助选择基因基因附近的DNA标记功能标记连锁标记11蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024蔬菜种质资源评价基因定位分子标记辅助选择种子纯度鉴定分子标记在蔬菜中应用12蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024蔬菜作物标记的性状标记/基因的代号引物序列（正向FW、反向RV）PCR（bp）标记类型PCR退火℃参考资料辣椒抗病毒基因（细菌性斑点）PepC2FV:TTGAAAAGGTTATCAATCATGGAARV:TCATCCCACAATCTTTTGAGC358

C.Eduardo,2010抗CMV病毒基因CaTm-int3HRMFV：TGGTGTTTTTATCAGCCTTAGCRV：GAAGGACAAGAATTCATGATATGG158

57Won-Hee,2010抗CMV病毒基因CaT1616BACFV:AATTGGTTCTGGATCACTGCCRV:CACCTTGATCTGCTCCTTTCTG200

57Won-Hee,2010抗CMV病毒基因240H02sp6FV:TTGGTTGAGGCAAGTTTTCARV:TCATTTTCCTATGTCATTCATGG472

57Won-Hee,2010茸毛基因HpmsE031FV:CCCTAAATCAACCCCAAATTRV:CCCCCATTACCTGACTGCAA167共显性50~56Hyun,2010茸毛基因TscaFV:AAACGCCATCATTCGTTTTCRV:CATGAAAGTTGACCCGAACA356共显性54~55Hyun,2010茸毛基因Tco-1FV:TCATTTTCCATACCTATACACCRV:TCAGTCAAACTAGACAGCAGATCC300共显性47~54Hyun,2010抗根结线虫基因E39/M41-339FV:ATTCAGAAAAAGACTTGGAAGGRV:TAAAGGGATTCATTTTATGCATAC315共显性57L.H.Wanga,2009蔬菜作物重要性状的分子标记13蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024蔬菜作物重要性状的分子标记蔬菜作物标记的性状标记/基因的代号引物序列（正向FW、反向RV）PCR产物（bp）标记类型（显性或共显性）PCR退火℃参考资料茄子抗青枯病

FW:GACTGCGTACCAATTCAGTTRV:GATGAGTCCTGAGTAACACGATG762SCAR显性36曹必好

抗镰刀霉枯萎病Me8/Em5FW：TGAGTCCAAACCGGACTRV：GACTGCGTACGAATTAAC426SRAP共显性50NedimMutlu等2008

抗镰刀霉枯萎病Em12/GLPL2FW：GACTGCGTACGAATTCTCRV：CA(AT)AG(AC)AA(AG)(AT)GG(AGC)A(AG)(AT)CC360SRAP-RGA显性55NedimMutlu等2008

抗青枯病E42M48E42：GACTGCGTACCAATTCAGTM48：GATGAGTCCTGAGTAACAC320AFLP显性56高玉梅（2006）

单性结实E75/M53E75：GACTGCGTACCAATTCGTAM53：GATGAGTCCTGAGATAACCG70AFLP显性56万翔(2006)

与果皮颜色相关的基因E10M19-1FW：GATGAGTCCTGAGTAACGGRV：GCTGAATTGGTACGCAGTC108AFLP共显性56孙保娟（2009）14蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/20241.基因序列收集基因基因登记号功能注释Tm-2aAF536201烟草花叶病毒抗性tm-2AF536199I-2AF118127番茄枯萎病抗性Cf-9AJ002236叶霉病抗性Cf-0AY639604Mi-1U81378根结线虫抗性mi-1CDQ863290蔬菜分子标记开发及分子标记辅助选择（以抗病基因为例）15蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/20242.引物设计针对SNP位点设计，引物3’端与模板互补或错配，并人为的在3’端的第二或第三位引入错配碱基。或者针对小片段的缺失和插入，将引物设计在缺失或插入片段两侧。16蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024Tm-2a基因SNP分析17蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024Tm-2a

引物（多态性：有无差异）A1:5’-GCCTCATTCAACTTCCTTCTGG-3’A2:5’-GCCAGTATATAACGGTCTAAAC-3’Cf-9引物

（多态性：有无差异）C1:5’-GTTCTTATCCTTTAACACCCA-3’C2:5’-TCCCTCCAAATTATTACTTCC-3’I-2引物

（多态性：大小差异）B1:5’-CCATCTCTCAAGGAACTGCGTC-3’B2:5’-GTAGTGGTGTGAGCAATGGGCA-3’Mi-1引物

（多态性：大小差异）D1:5’-TTCTCTAGCTAAACTTCAGCC-3’D2:5’-TTTTCGTTTTTCCATGATTCTAC-3’3.等位基因特异PCR引物18蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/20241）Tm-2a特异引物PCR检测与接种鉴定1234567CKM500bp接种烟草花叶病毒幼苗A:A53（感）B:LA1221（抗）1-6:A111、A114、A53、A115、A113；7:LA1221（抗）；CK：空白对照；M：MarkerTm-2a特异引物对不同番茄品系基因组的PCR检测AB4.抗病基因标记的验证标记的有无差异：抗性基因型扩展出片段19蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/20242）Mi特异引物PCR检测与接种鉴定AB图A:接种前幼苗；B:接种后植株；C1：LA2819（抗）；C2：A53（感）12MLA2819A53LA2819A53C标记的大小差异：抗性基因型扩展出较小片段20蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/20243）叶霉菌抗性标记检测及接种鉴定7份番茄材料是目前国内外通用的含不同抗叶霉病基因的品系。MCK1234567500bpCf-9特异引物在7份材料中的PCR检测1-7:Ont7719（抗），Ont7717、V121、Ont7516、Vetomold、Leafmouldresister、Moneymaker；CK：空白对照；M：Marker标记的有无差异：抗性基因型扩展出片段21蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024CK12345678M750bp500bp4)I-2抗枯萎病特异引物PCR检测1-6:A53、A101、A57、A111、A104、A103；7-8：LA3847（抗）、LA4026（抗）标记的大小差异：抗性基因型扩展出较小片段22蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024（1）基因标记选择F3代分离群体的三抗植株对引进抗病F2进行2-3代自交，自交过程中以基因特异引物对分离后代的单株进行基因标记辅助选择，选择对象为三抗性植株（TMV-2a,Mi-1，I-2）。5.蔬菜抗性基因标记辅助育种

23蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024500bp1）番茄F3材料Tm-2a的PCR分析（有无差异）1：LA1221(抗）；2：A53（感）；3-20：3275F3单株24蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024750bp2）番茄F3材料I-2的PCR分析（大小差异）1：A6（感）；2：LA4026（抗）；3-21：3275单株；CK：空白对照；M：Marker600bp25蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/20241000bp750bp3）番茄F3材料Mi-1的PCR分析（大小差异）

ck1：LA2819(抗）；ck2：A6(感）；1-22：3275单株；M：marker26蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/20244）利用分子标记辅助选择对F3～F4的单株检测结果植株编号PCR检测抗病基因标记综合鉴定的植株抗病情况Tm-2aI-2Mi-13-12-1+-+2抗3-12-2+++3抗3-12-3+++3抗3-12-4+--1抗3-12-5++-2抗3-12-6+++3抗3-12-7+++3抗3-12-8+++3抗3-12-9+++3抗3-5-10+--1抗3-12-11+++3抗3-12-12+++3抗3-12-13+++3抗3-12-14+++3抗3-12-15+-+2抗植株编号PCR检测抗病基因标记综合鉴定的植株抗病情况Tm-2aI-2Mi-13-12-8-1+++3抗3-12-8-2+++3抗3-12-8-3+++3抗3-12-8-4+++3抗3-12-8-5+++3抗3-12-8-6+++3抗3-12-8-7+++3抗3-12-8-8+++3抗3-12-8-9+++3抗3-12-8-10+++3抗3-12-8-11+++3抗3-12-8-12+++3抗3-12-8-13+++3抗3-12-8-14+++3抗3-12-8-15+++3抗3-12-8-16+++3抗3-12-8-17+++3抗3-12-8-18+++3抗3-12-8-19+++3抗3-12-8-20+++3抗自交筛选27蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024（2）聚合四抗植株的标记辅助选择

(Tm-2a,I-2,Mi-1,Cf-9)杂交聚合四抗性材料的PCR检测，以4个基因标记分别对杂交聚合的22个单株基因组进行PCR检测。检测结果显示9个单株已经聚合了四种抗病基因（Tm-2a+Cf-9+I-2+Mi-1）28蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024四个基因纯合株系与亲本苗期接种鉴定自交系TMVI-2Mi-1Cf-9L18HR（0.71）HR（2.19）R（4.30）R（5.36）L19HR（1.32）HR（2.01）R（5.42）HR（1.70）L20R（2.60）HR（3.66）R（5.56）HR（2.70）L21HR（096）HR（2.87）R（6.77）HR（1.42）#3275HR（1.65）HR（3.31）R（8.19）S（59.82）JF-18S（52.36）S（61.68）S（56.32）HR（2.12）注：HR：高抗；R：抗；S：感；（）：病情指数；Note:HR:Highresistance;R:Resistance;S:Susceptible;（）:Diseaseindex29蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024受体亲本×供体亲本A(无优异基因)(含优异基因A)受体亲本×供体亲本B(无优异基因)(含优异基因B)

F1(含优异基因A)×F1(含优异基因B)复杂杂种(分离群体)受体亲本×供体亲本C(无优异基因)(含优异基因C)中选杂种个体×F1(含优异基因A和B)(含优异基因C)复杂杂种(分离群体)中选杂种个体×受体亲本(含优异基因A、B和C)新育成的优异品种

(受体亲本遗传背景+优异基因A、B和C)回交1~2代，标记辅助选择自交标记辅助选择标记辅助选择分子标记辅助基因聚合30蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024含纯合Ty1位点（抗性）的株系会产生402、31bp的带，含纯合ty1位点的植株（感病）则会出现31、47、354bp的带，含Ty1/ty1位点的株系（杂合抗性）则会出现402、354、47、31bp的条带。（3）新病害的标记开发检测（番茄黄化曲叶病毒）Ty-1位点检测Ty-1CAPS标记CAPS1F：5'-TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT-3'CAPS1R：5'-CGGATGACTTCAATAGCAATGA-3'纯合感病纯合抗病杂合抗病31蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024用引物TYF5/TYR6扩增的PCR产物Ty-3/Ty-3基因型扩增出一条450bp的条带；Ty-3/ty-3基因型的材料扩增出450bp和320bp的两条带。33:07-026；34:07-026x7898C-0；35:07-026x9179；36:07-026x7818D-1；48:9179，43、44、45、46、47和48是感病对照Ty-3SCAR标记TYF5：5’-GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC-3’TYR6：5’-GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC-3’450bp320bpM123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142434445464748杂合抗病纯合抗病纯合感病32蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024材料：华番2号(F1)、Tov-2-11-8-1(母本)、A5（父本）华番3号(F1)、Tov-1-25-5-2(母本)、A101(父本)SSR引物:45对

6.DNA标记鉴定蔬菜品种指纹图谱33蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024华番2号及亲本中SSR检测的等位基因数引物名称等位基因数所在染色体正向引物

反向引物SSR20212GAGGACGACAACAACAACGAGACATGCCACTTAGATCCACAAW12132CAGACTGTGACAAGGCTGATTCGCATGAATAGCTGAGCAGATTGATCGSSR4746TCCTCAAGAAATGAAGCTCTGACCTTGGAGATAACAACCACAASSR23749GTGGTAACGGCAAAGGGACTCTTATGGCCTTAGCAGCCAG平均3.3第一步：筛选在亲本之间差异的SSR标记第二步：验证SSR标记在F1杂种中的多态性34蔬菜品质基因工程及分子标记辅助育种5/9/2024华番3号及其亲本中SSR检测的等位基因数引物名称等位基因数所在染色体正向引物

反向引物SSR23729GTGGTAACGGCAAAGGGACTCTTATGGC