生物芯片技术.ppt

1、第五讲 生物芯片技术,什么是生物芯片（BIOCHIP）？ 生物芯片技术是80年代发展起来的一门新兴技术，它可将成千上万乃至几十万个与生命相关的信息集成在一厘米见方的芯片上，对基因 、抗原、活体细胞和组织进行测试分析。因具有与芯片相似的微型化和大规模分析、处理生物信息的特点而得名。目前已有多种芯片出现，以DNA芯片、蛋白质芯片和组织芯片为其代表。,把生物活性大分子（核酸和蛋白质）、细胞、组织等，密集排列固定在固相载体上所形成的微型检测器件。 生物芯片技术被誉为1992年的十大科技 发现之一。,检测原理：特异性的分子间相互作用，如：核酸杂交、抗原-抗体特异性结合、蛋白-蛋白间特异性结合等 高度集成

2、的、机电一体化的检测系统，借助计算机自动搜集、储存、分析和报告检测信息,生物芯片的制作过程,printing,生物芯片的操作平台 预制的基因芯片 芯片滚动杂交仪 全自动芯片洗涤工作站 高分辨的芯片扫描仪 智能化的分析软件,生物芯片的特征及优点,A 、高通量提高信息量 B 、平行化提高信息的可比性 C 、微量化降低待检样品用量 D 、自动化提高工作效率 E 、低成本可迅速普及推广,生物芯片的种类,DNA芯片（基因芯片） 蛋白质芯片 组织芯片,DNA芯片技术 （一）概念 DAN芯片(DNA chip)又称为基因芯片（gene chips）、 DNA阵列（DNA array）、cDNA芯片（cDNA

3、 chips）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。,DAN芯片（DNA chip）技术是一种大规模集成的固相核酸杂交技术，即在固相支持物（硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜）上以原位合成或显微打印的方式排列一系列寡核苷酸探针、cDNA探针或基因组探针，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息包括核酸序列、基因突变、基因表达差异、基因作图、DNA指纹分析等。,核酸分子杂交,靶DNA,探针DNA,杂交前 杂交后,（二）DNA芯片的主要类型 按探针分为： 1寡核苷酸芯片 主要用于DNA序列分析、基因突变及基因多态性分析。 2cDNA芯片 由基因库中的mR

4、NA逆转录成cDNA，制成cDNA片段（500-5000bp），由PCR扩增、纯化，按矩阵方式固定在玻璃片或其它载体上构成，可用作基因表达分析。当比较两个样品中的基因表达差异时分别以不同颜色的荧光物质或生物素进行标记，然后一起混匀，与阵列上的探针cDNA杂交。,按制备方式可分为： 1原位合成芯片（synthetic genechip）：采用显微光蚀刻等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片。该芯片的集成度高，可达10万-40万点阵/平方厘米。但合成的寡核苷酸探针较短，一般为8-20nt，最长50nt。,2DAN微集阵列（DNA microarray）： 将预先制备的DNA片段以显微打

5、印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。这类芯片的集成度相对较低，可达1万-10万电阵/平方厘米。但使用的探针组来源比较灵活，可以是合成的寡核苷酸片段，也可以采用来自基因组的较长的DNA片段；可以是双链DNA，也可以是单链DNA或RNA片段，探针长度可达100-500nt。,芯片的种类,原位合成法 Oligonucleotides 合成后点样法 Oligonucleotides cDNA Genomic DNA,寡核苷酸原位合成,合成后点样法,（三）DNA芯片技术的基本原理及方法 DNA 芯片是以大量的已知碱基序列的寡核苷酸片段作为探针，检测样品中哪些核酸序列与之互补，然后通过定性、定量分

6、析得出样品的基因序列及表达的信息。其方法主要包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分析四个方面。,1 芯片制备 （1）支持物的预处理 支持物：实性材料（硅片、玻片、瓷片）；膜性材料（聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜） 实性材料需要进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基等活性基团。 膜性材料通常要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等，使其带上正电荷以吸附带负电荷的DNA探针。,Acceptable Silanation,Unacceptable Silanation,Variations in Commercially Available Coated Slides,（2）原位合成芯片的制备：采用显微蚀刻

7、（photolithography）技术或压电打印（piezoelectric printing）技术，在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而合成，探针被有序固化于支持物上。 （3）DNA微集阵列的制备：DNA微集阵列的制备采用的是预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上。,氨基修饰的DNA片段,DNA样品的固定,探针的制备：可采用已克隆的基因片段；PCR或RT-PCR扩增的基因片段；人工合成的DNA片段；肽核酸。 打印：喷墨打印和针式打印 探针的固化：在支持物上打印DNA探针后，需将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定。可通过紫外线交联或schiff

8、碱连接法来实现。,Spot Printing with Multiple Pin Types,2 样品的准备 包括样品的分离纯化、扩增和标记等过程。 （1）样品的来源：主要从活组织或血细胞中获得DNA或mRNA。分离纯化的核酸分子需要进行扩增，且要求对样品中的靶序列进行高效而特异的扩增。基因组DNA通过PCR直接扩增；mRNA则需逆转录，制备cDNA。,（2）样品分子的标记： 主要采用荧光标记法，也可用生物素、放射性核素等标记，样品的标记在PCR，PT-PCR等过程中进行。,带有标记的dNTP（Cy3-dNTP、Cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通过DNA或cDNA扩增的过

9、程，掺入靶分子序列。也可在制备引物时，掺入标记的核苷酸，扩增靶序列后，使扩增产物末端带有标记。 荧光标记分辨率高于同位素标记，且可以采用双色分别标记带测和对照样品，有助于结果分析和判断。,3 分子杂交 待测样品经扩增、标记等处理后，即可与DNA芯片上的大量探针进行分子杂交，将未杂交的分子洗去。,4 杂交信号的检测与数据分析 待测样品与芯片上的探针阵列杂交后，荧光标记的样品结合在芯片的特定位置上，未杂交的分子被除去。然后在激发光的激发下，含荧光标记的DNA片段发射荧光。,样品与探针严格配对杂交的分子发生强荧光信号 不完全杂交（含1-2个错配碱基）分子显示较弱信号（为前者的1/35-1/5） 不能

10、杂交则检测不到荧光信号或只检测到芯片上原有的荧光信号 荧光强度与样品分子的含量有一定线性关系 芯片杂交信号检测最常用的方法是激光共聚焦显微扫描技术,（四）DNA芯片技术的特点和存在的问题 特点： 1高度并行性：有极高的多样品处理能力，对大量的生物样品可平行检测，使实验的进程大大提高，且有利于DNA芯片技术所展示图谱的快速结果分析。 2多样性：在整个芯片中能对样品进行一次全面的分析，从而大大地提高分析的精确性，避免因不同的实验条件产生的误差。,3微量化：是当前芯片制造中普遍的优势，可以减少试剂用量和反应体积，从而提高样品浓度和反应速率。 4自动化：高度的自动化可降低制造芯片的成本和保证芯片制造质

11、量的稳定性。 5防止污染，有效排除了外界因素的干扰。 存在的问题：技术成本昂贵、复杂、重复性差、分析范围较窄等。,（五）DNA芯片技术的应用 DNA 芯片技术已成为后基因组时代基因功能分析的最重要的技术之一，通过对大量的生物样品进行平行、快速、敏感、高效的基因分析，在DNA序列测定、基因表达分析、基因诊断、药物研究与开发以及工农业、食品与环境监测等领域将得到广泛的应用。,基础研究,农业,药物筛选,军事,医学研究,临床诊断,司法,环境保护,基因芯片技术的应用领域,.,.,.,1DNA序列测定：通过大量固化的探针与生物样品的靶序列进行分子杂交，产生杂交图谱，排列出靶DNA的序列，这种测序方法称为杂

12、交测序（sequencing by hybridization，SBH）。操作时，合成已知序列的所有可能的n体寡核苷酸，将其固定在芯片表面，然后与标记的待测靶序列杂交，经过排列组合，即可得到待测的DNA序列。,2基因诊断： 应用DNA芯片技术可以在DNA水平上检测与疾病相关的内源性或外源性基因 应用cDNA芯片可以在mRNA水平分析同一组织在不同发育阶段、正常及病理状态基因表达的差异，也可分析不同组织同一基因在正常及病理状态下表达的差异 为疾病诊断与分类、病源微生物分型提供科学信息，因而在遗传性疾病、感染性疾病、肿瘤等疾病的诊断中可得到广泛的应用。,Composite,Adult (Cy3),

13、Fetal (Cy5),Human Brain Gene Expression Profiling,Normal,ADH,DCIS,IDC,Genes,目前，检测逆转录病毒基因的HIV芯片、检测p53基因突变芯片、用于诊断药物代谢缺乏症的p450芯片、人类急性白血病诊断与分类芯片、丙型肝炎分型与HLA分型等芯片已纷纷问世并用于临床实验室。预计越来越多的疾病以及致病微生物感染的芯片诊断技术将成为一项常规的实验室检测技术。,3基因表达分析： 以寡核苷酸或cDNA为探针制备的DNA芯片，可平行、自动化检测大量基因的表达 理论上，10万个基因的人类基因组可在一张芯片上、一次杂交反应中观察其在目的细胞中

14、的实际表达状态，包括表达与否，表达丰度 两种相关细胞的实验结果也可在一张芯片上同时显示出来，便于在最小实验误差的情况下比较二者的细微差别。,4人类基因组分析及发现新基因的研究 与传统的基因测序技术相比，DNA芯片破译基因组和检测基因突变的速度要快数千倍，正被广泛用于基因组研究。 5基因突变和多态性检测 以往对于基因突变和基因多态性的研究多采用自动测序、异源双链分析、蛋白截短检测等方法，过程复杂，分辨率低。应用DNA芯片技术可克服这些缺点，并可获得更高的分辨率。,应用举例： 2006年，科学家利用 SNP 芯片技术进行 694 个人的全基因组关联分析 , 发现 INSIG2 基因附近的一个 SN

15、P 与儿童和成人的肥胖病关联 。 该 SNP 位于INSIG2 基因转录起始位点上游 10kb 处。 以往对小鼠和人的连锁分析已经暗示 INSIG2 基因区域是肥胖病的一个因素 。,6药物研究与开发 DNA芯片技术在药物研究与开发中可应用于药物筛选、新药发现、合理用药、中草药鉴定和真假药辨别等。 利用DNA芯片技术可比较正常组织（细胞）与病变组织（细胞）中大量相关基因表达的变化，从而发现一组疾病相关基因作为药物筛选靶标。 应用DNA芯片进行基因水平的研究分析，有助于为病人用药提供更为确切的客观指标。 此外，DNA芯片技术可快速分析病人个体细胞对多种药物的反应性，即通过体外实验，以最快速度挑选出

16、最为有效的治疗药物。,7其他领域 法医学鉴定、食品工业、环境检测等方面，DNA芯片技术也将具有极大的潜力。,蛋白质芯片（protein chips）,蛋白质芯片是高通量、微型化和自动化蛋白分析技术，通过芯片表面探针蛋白质点阵，可特异地捕获样品中的靶蛋白，然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。,基本原理： 蛋白质芯片技术是将各种蛋白质（如抗体）有序地固定在滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片。 然后用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成份与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度。 通过荧光强度分析蛋白质

17、与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。,抗体芯片（Antibody Microarray）,将不同抗体按照类似基因芯片的方法点阵在特定的片基上，利用抗原抗体结合原理，采用化学发光或荧光检测标记抗体或抗原，对检测样品中的蛋白作定性和定量分析。 作用：可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的丰度。,抗体芯片的特点： 特异性高 利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白 可 定 量 利用单克隆抗体芯片，由于结合至芯片上的抗体是定量的，故可以测定抗原 功 能 广 利用单克隆抗体芯片，可替代western blotting；单克隆抗体芯片，可互补流式细胞仪不足的功能，如将细

18、胞溶解，可测定细胞内抗原，而且灵敏度远高于流式细胞仪,操作流程 蛋白质样品制备提取蛋白质蛋白质标记凝胶过滤 去除未结合染料与抗体芯片温育杂交扫描分析结果,组织芯片（tissue microarray） 组织芯片是1998年Kononen等在Nature杂志上首次报道的一种高通量技术。 它是将成百甚至上千种组织样本有序地固定在一张玻片上，用于特定分子的分析，如DNA、mRNA的 原位杂交（ISH）和蛋白质的免疫组织化学（IHC）染色。,组织芯片技术可以与DNA、RNA 、蛋白质、抗体等技术相结合，与传统的病理学技术、组织化学及免疫组化技术相结合，在基因、基因转录和相关表达产物生物学功能三个水平上

19、进行研究,组织芯片的特点 可提高实验效率：组织芯片可将几十甚至数百例组织样本同时设置于同一切片，因此只需一次操作就可完成普通实验所需的几十次操作 有助于减少实验误差：实验条件可在最大限度上保持一致，减少因普通实验方法中分批、分次实验造成的因实验条件不同 引起的实验误差 便于设置实验对照 有利于原始存档蜡块的保存,组织芯片的制备一般使用美国Beecher仪器公司销售的组织点样仪。供体组织快要求具有组织代表性，厚度至少1mm，最适3-4mm，点样时每个样品为圆盘状，直径为0.6-2.0mm。 制作方式有两种：石蜡切片法和冰冻切片法,组织芯片的检测技术包括：原位杂交（ISH）、免疫组织化学（IHC）

20、、荧光原位杂交（FISH）等各种整片组织切片上分子检测技术。 实验结果的判定通常有病理学家在光学显微镜下进行，每小时可处理成百个数据点；也可获得图像资料后使用软件分析。 现已发展出共聚焦荧光显微镜为基础的系统，附带图像分析算法用于自动分析组织芯片FISH结果。,组织芯片技术为从成千上万的后选基因中筛选到与某一疾病类型特异相关的分子标志物提供了新的高效手段。 该技术实现了基因表达谱的研究与临床应用的快速结合，通过揭示后选基因的细胞定位、组织分布与临床显著性信息，尤其适合以基因组为基础的诊断和药物靶标的发现。,组织芯片在癌症研究方面具有广阔的运用前景，主要是分析大量样本量下的肿瘤发生、发展过程中的分子变异情况（筛选新型肿瘤分子标志物）、识别诊断和预后指标，以及验证新发现的具有诊断和治疗作用的基因。 目前，已有乳腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌和脑癌等使用组织芯片进行了肿瘤分子标志物研究。,液相芯片,液相芯片体系由许多不