糖化酶活力测定.ppt

1、实验三,糖化酶活力的测定,一、目的和内容 目的：掌握测定糖化酶活力的方法和学习测 定的原理 内容：.测定糖化酶活力 .计算糖化酶活力,二、基本原理 糖化酶（glucoamylase）又称淀粉葡萄糖苷酶（系统名淀粉，葡萄糖苷酶，.），是一种外切型淀粉酶，能从淀粉分子非还原端依次水解，键切下葡萄糖单位。也能水解麦芽糖和支链淀粉分支点的，键，但水解速度甚慢。该酶能广泛用于酒精、酿酒、葡萄糖及果葡糖浆的制造上糖化酶是一种胞外酶，可利用黑曲霉、海藻曲霉、和根霉等生产。,测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰爱农法（法） 、Schoorl法（法）和对硝基苯酚葡萄糖法（法）等方法。本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠

2、法。糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解，糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所差别。糖化酶的最适pH范围是45,最适应温度范围是5060。,次碘酸钠法,碘与NaOH作用能生成NaIO(次碘酸钠,弱氧化剂),而C6H12O6 (葡萄糖)能定量地(1:1)被NaIO氧化.在酸性条件下,未与C6H12O6 作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ,便可计算出C6H12O6 ,的含量.以上各步可用反应方程式表示如下:,1.I2 与 NaOH作用:

3、 I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2.C6H12O6 与NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI 3.总反应: I2 +C6H12O6 +2 NaOH=C6H12O7 +2 NaI+H2O 4. C6H12O6作用完后,剩下的NaIO在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 5.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6HCl=3I2 +6NaCl +3H2O,在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与 1mol NaIO 作用，而1molI2 产生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖与1

4、molI2 相当。,6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI,三、试剂与器材 1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、pH计、电子天平； 3.试剂 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5%淀粉指示剂。,四、操作步骤 1.取4个带塞的试管（3个作平行重复、1个作空白对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 水浴中预热10min。 2.加入酶液0.5m

5、l（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）于40 ，反应10min；反应结束时，立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的塞子打开）。,3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意：加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处放置15min后加入1N硫酸2ml； 4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品（A）、空白对照（B）；,5.

6、计算： (1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：,酶活力单位（U/ml）= （BA）（N/2） 180.1（8/5）2 （60/10） 式中: B- 空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数； A- 酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平均值）； N- 硫代硫酸钠的当量浓度。,（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀粉溶液水解生成1mol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）： 酶活力单位（U/ml）= （BA）10-3 （N/2）（8/5）1062 （1/10） 式中符号与前式相同。,五、实验报告 将重复3次测定的

7、糖化酶活力结果记录在实验报告中，并按提供的两种计算公式分别计算出酶活力。 六、问题和思考 1.糖化酶的作用有何特点？ 2.次碘酸钠法的测定原理；你认为实验过程中哪些步骤关键，应注意些什么问题？ 3.为什么用失活酶液作为空白对照而不用蒸馏水？ 4.两个计算糖化酶活力的公式中各项的意义及两者各有何特点？,七、注意事项 1.注意安全; 2.滴定操作要规范、仔细准确; 3.认真完成实验报告； 4.实验完成以后须清扫整理才能离开。,在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与 1mol NaIO 作用，而1molI2 产生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。,6.析出的I2 可用标准Na

8、2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI,没有葡萄糖的情况 1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应 3I2+6 NaOH =NaIO3+5NaI+3H2O 5.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +3H2SO4=3I2 +3Na2SO4+3H2O,5.计算： (1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：,酶活力单位（U/ml）= （BA）（N

9、/2）产生的葡萄糖的量 180.1 MG （8 样品总量8ml /5反应量5ml） 2 酶液0.5ml （60/10） 反应时间10min 式中: B- 空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数； A- 酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平均值）； N- 硫代硫酸钠的当量浓度。,（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀粉溶液水解生成1mol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）： 酶活力单位（U/ml）= （BA）10-3 （N/2）产生的葡萄糖的量 （8/5） 106 转为umol 2 酶液量0.5ml （1/10）转为1min 式中符号与前式相同。,（1）2%可溶性

10、淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa3H2O)2.722，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）20%氢氧化钠溶液 （4）0.1mol/L碘液 （5）0.1mo1/L氢氧化钠溶液 称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。 （6）1mol/L硫酸溶液 量取浓硫酸5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00m