蛋白质的化学PPT演示课件

1,蛋白质的化学,.,2,第一节 Pr-生命的物质基础,一、Pr-生物体基本成分 蛋白质（protein, Pr）普遍存在 构成细胞组织 占人固体量45%（表4-1） 二、Pr具有多样性的生物学功能 生命现象和生理活动往往是通过Pr来实现。 1.生物催化作用； 2.代谢调节作用； 3.免疫保护作用； 4.转运和储存作用； 5.运动支持作用； 6.控制生长和分化； 7.接受和传递信息作用； 8.生物膜的功能。,.,3,第二节 蛋白质的化学组成,一、蛋白质的元素组成 含有C、H、O、N、S、P、Fe、Mo、I、Zn。 氮含量恒定1319%，平均为16%。 据此, 可定氮测定样品中Pr的含量。 Pr含量含氮量100/16(6.25),.,4,二、Pr 结构的基本单位氨基酸,氨基酸（amino acid, AA） 天然的AA约180种； 组成蛋白质有20余种称之为基本AA(编码AA）（一）AA的结构 化学结构通式： COOH H2N C H R(不同AA各异） 侧链基团,.,5,AA结构特点： 1.基本AA为AA，脯AA为亚氨基酸 2.不同AA，R侧链不同 3.除甘氨酸（R=H)外，其余AA的C为不对称碳原子，具旋光性，有构型。 除甘氨酸外，基本AA均为L- AA。 AA名称可用英文三字符或一字符表示,.,6,DAA存在于抗生素或植物生物碱中，脑中有些游离的DAA存在，但不参与Pr合成。,.,7,（二）氨基酸的分类,以R侧链基团的结构性质为分类基础1.非极性R基AA：R基为疏水性的 丙、缬 、亮、异亮、甲硫（蛋）、苯丙、脯、色2.极性不带电荷R基AA： 丝、苏、酪、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸3.带负电荷R基AA：酸性AA：天冬、谷4.带正电荷R基AA：碱性AA：赖、精、组蛋白质中其他AA：无翻译密码，Pr合成后加工而成的：羟脯（Hyp)、羟赖(Hyl)、胱氨酸、T4（四碘甲腺原氨酸）非蛋白质AA：不存在于Pr中，游离形式存在。 丙氨酸、D-苯丙氨酸、同型半胱氨酸、氨基丁酸等等,.,8,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性R基AA：,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,.,9,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丝氨酸 serine Ser S 5.68,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,2.极性不带电荷R基AA,.,10,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 碱性氨基酸,.,11,（三）氨基酸的分离与分析,测定蛋白质分子组成和结构的基础分离方法：溶解度法、等电点法、特殊试剂沉淀法、离子交换法1.离子交换层析： 利用离子交换剂对不同AA吸附能力的差异进行分离。 在一定条件下，各种AA所带的电荷性质和数量不同，而与离子交换剂的亲和力各异，控制条件将它们逐个分离，然后进行定性和定量的分析。,阴离子交换树脂：本身带正电荷可与负电荷物质结合；阳离子交换树脂：本身带负电荷可与正电荷物质结合,.,12,2.自动氨基酸分析仪：准确测定蛋白质样品中各种AA量 先酸水解获得水解液（游离AA），再进行柱层析（离子交换），用不同pH和离子强度的缓冲液进行梯度洗脱，分离。全过程由计算机控制完成。,.,13,3. 高效液相色谱 固定相表面积大（颗粒细）；溶剂系统高压，洗脱速度快。替代多种柱层析系统。 用于蛋白质分析、制备等,.,14,4.生物质谱 质谱mass spectrometry，MS：带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小排列的图谱 基本原理：AA（或肽）分子在质谱的离子化室中轰出后被电离，所生成的各种正离子碎片在高压电场中加速，经过磁场时被偏转. 通过改变加速电压或磁场强度，可只允许某一质荷比的离子通过出口狭缝，被离子捕获器收集，经过信息的放大处理，记录成条状的质谱图，与标准样品质谱图对照，得到未知样品的结构信息。,.,15,第三节 蛋白质分子结构,一、蛋白质的一级结构primary structure 共价结构或基本结构蛋白质的一级结构是指由不同种类、数量的氨基酸，通过肽键而构成的排列顺序。为蛋白质结构与功能的基础。,.,16,（一）肽键和肽链 1.肽键（peptide bond）：又称酰胺键“-CO-NH” 由一分子AA的 羧基与另一AA的氨基缩合脱水而成。,.,17,2.肽链：polypeptide chain AA通过肽键相连的化合物 两个AA组成为二肽；三个AA组成为三肽；依此类推。 10各以上AA组成的肽多肽 肽链中的氨基酸部分已不完整，所以称之为 氨基酸残基,.,18,肽链特点：（1)共价主链：多肽链骨干为AA羧基与（另一）AA的氨基形成的肽键规则重复排列而成。 侧链：R基部分,.,19,肽链特点：（2)结构方向性： 一条多肽链有两个末端 氨基末端（N端）：含自由氨基的一端； 羧基末端（C端）：含自由羧基的一端。 （3)书写命名习惯： N端在左；C端在右。命名亦是从左到右。 （4)一种排列即为一种蛋白质，所以自然界虽只有二十种AA却构成了繁多的蛋白质种类,.,20,.,21,Pr或多肽 AA残基数 Pr或多肽 AA残基数加压素 9 干扰素 166胰高血糖素 29 血红蛋白 574 胰岛素 51 球蛋白 1250 核糖核酸酶 124 FA合成酶 20000 烟草花叶病毒 33650,蛋白质一级结构的稳定力量肽键 （有人认为二硫键亦属） 自然界存在无分支的开链多肽，环状多肽等。,.,22,（二）蛋白质一级结构测定原理,1.AA组成的分析： 包括样品纯化、多肽链数目测定、AA组成的分析（水解后，自动分析仪测定）。2.N末端AA分析：确定多肽链数目，AA排列顺序的测定。 （1)二硝基氟苯法（DNFB)： N末端与DNFB反应，生成DNP多肽衍生物（其对酸稳定性高）。肽链再经酸水解后，DNPAA（N末端）用有机溶剂提取分离，用层析进行定量或定性。 （2)二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）：基本同前。 DNS法生成的N端AA具强烈荧光，灵敏度高，可直接测定。 经酸水解，不能重复应用。,.,23,二甲氨基萘磺酰氯；丹（磺）酰氯,.,24,(3) Edman降解法：仅释放N末端残基 特点： 苯异硫氰（PITC）与肽的N末端氨基反应，碱性条件下（pH9.09.5)生成苯氨基硫甲酰基衍生物（PTC肽），酸性中经裂解，环化为PTHAA和剩余多肽，抽提后鉴定。,.,25,3.C末端AA的分析（较前法误差大）,（1）肼解法 多肽与无水肼加热发生肼解，经处理，C末端AA以游离形式释出后在上清液，而其他氨基酸则形成沉淀，用DNFB法或DNS法及层析鉴定（2)羧肽酶法： 肽链外切酶，特异水解C-末端AA，常用 羧肽酶A：水解脂肪族或芳香族AA构成之C末端； 羧肽酶B：水解碱性AA构成之C端。,（4）氨肽酶法：肽键外切酶。 从肽链的N端开始逐个切掉AA。由于酶水解速度不同而使用受限。,.,26,4.大分子多肽AA顺序的确定,大分子需更复杂的步骤。 先将大分子多肽裂解为小片段，分离纯化测序。 裂解法：化学裂解法，酶解法。 可根据裂解方法特点选择多种结合，综合分析，推导出肽链中AA排列顺序。 另有：X线结构分析法； 气质谱连用法；核酸推导法（最有效）对蛋白质一级结构进行测定。,.,27,二、蛋白质的构象conformation （ 空间结构、立体结构、高级结构、三维构象）,指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向 以一级结构为基础 空间构象为蛋白质生物活性、功能所必需,.,28,（一）维持蛋白质构象的化学键（稳定力量）,主要是次级键（副键） 键能小，稳定性差，但数量众多，使其在Pr的空间构象的稳定性中起重要作用1.氢键(=OH-）；2.疏水键；3.盐键（离子键）；4.配位键(与金属离子）；5.二硫键(-s-s-)；6.范德华引力。 Van der Waals,.,29,（二）蛋白质的二级结构 secondary structure,多肽链中主链骨架中若干肽单位各自形成局部的有一定规则的结构。 稳定力量：氢键 形式： 螺旋、折叠、拐角、无规卷曲,.,30,1.肽单位（肽平面）peptide unit,肽键与相邻的两个 碳原子所组成的基团（形成构象）特性（1）肽键具有双键性质，不能自由旋转 （2) 肽单位为刚性平面结构即六个原子位于同一平面上 （3) 与CN相连的H和O与两个碳原子反向分布,.,31,2. 螺旋（ helix）,Pr中多个肽平面通过AA- 碳原子的旋转, 多肽链的主骨架沿中性轴盘曲成稳定的 螺旋构象。结构特征：（1）右手螺旋，每3.6个AA旋转一周，螺距为0.54nm，肽平面与螺旋长轴平行（2)氢键为主要次级键： 相邻（1-4）肽平面上的N-H和CO生成氢键（3）AA残基的R基团分布在螺旋外侧 R基团影响螺旋稳定性：酸（碱）性AA连续，或较大的R基团，N原子无H游离（脯）均不能形成螺旋,.,32,.,33,3.折叠结构（ pleated sheet structure） 又称片层结构,结构特征：（1）肽链的伸展使肽键平面之间折叠成锯齿状；（2) 肽链平行排列，相邻肽链之间的肽键交替形成氢键 为维持构象的主要次级键（3)肽链平行走向有顺式和反式两种，N端同侧为顺式， 不在同侧为反式；（4)AA残基的R基团在片层的上下,.,34,4.折角（转角）（ -bend）,伸展的肽链形成180回折U型转折结构 由连续的四个AA残基构成， 第一个AA残基的O与 第四个AA残基的N-H形成氢键。这一段结构往往第二个AA残基为Pro（亚氨酸）。,5. 无规线团（卷曲）random coil 除上述构象外的不规则构象（自由折叠或无规线团）,一种蛋白质的二级结构并非单纯的 螺旋或折叠，由不同类型的组合。,.,35,（三）超二级结构：模块或模序(motif) 在多肽链内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。如：、等。,.,36,（四）结构域domain,是位于超二级结构与三级结构间的一个层次。 在较大的蛋白质分子中，多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密三维实体。 每个结构域由100200AA残基组成，各有独特的空间结构，并担负不同的生物学功能。 较大的蛋白质有多个结构域，可以是相似的，也可能是完全不同的。 IgG由12个结构域组成,.,37,.,38,（五）蛋白质的三级结构tertiary structure,多肽链中所有原子或基团的在三维空间的整体排布。,稳定三级结构的次级键：疏水键、氢键、盐键,.,39,（六）蛋白质的四级结构 quarternary structure,由两个或两个以上的亚基之间相互作用，彼此以非共价键相连而形成更复杂的构象。1.亚基（又称亚单位，subunit）:四级结构中具独立三级结构的多肽链寡聚体oligomer：210个亚基组成的具有四级结构的Pr。 更多的亚基数目则称多聚体（polymer）2.亚基间结合力：疏水键、盐键、氢键、范德华力、二硫键,.,40,.,41,蛋白质的四级结构小结图示如下：,motif,domain,.,42,三、蛋白质和多肽合成的基本原理,（一）化学合成法的基本原理 一级结构的阐明使得合成某些特定的Pr成为可能。 1.AA基团保护： 合成过程中将不该参加反应的基团加以封闭或保护，以减少副反应的发生。条件：合成肽时保护起来，合成后易除去，并不引起肽链的断裂。 氨基保护： 苄氧羰酰氯（Cbz-Cl），叔丁羰酰氯（BOC-Cl) 羧基保护：醇酯化,.,43,2.多肽的液相合成,（1) AA的基团的保护（2) 接肽缩合反应： 接肽缩合剂：N,N-二环已基碳二亚胺（DCCI) （3) 肽合成：将基团保护剂除去，分离纯化。,.,44,.,45,3.多肽的固相合成,.,46,（二）采用生物技术合成蛋白质,现代生物技术发展为蛋白质的生物合成提供了新兴的极为重要的有效手段。1.基因工程 genetic engineering（DNA重组） 利用DNA重组技术合成蛋白质类药物愈来愈多，如胰岛素、生长激素、EPO、白介素等。生物反应器：转基因动物 将目标基因导入动物的受精卵或单卵胚胎细胞并在动物体内正常表达，从其体液与组织中分离外源基因的表达产物（细胞因子等）优点：不干扰动物的正常代谢；从体液（奶）中易于提取纯产品；基因表达可精确控制；产量高。,.,47,2.细胞工程 cell engineering 细胞为构成生命的基本单位。可自身合成蛋白质。 用细胞融合技术建立可合成制备许多蛋白质类药物（单克隆抗体，EPO，干扰素等）3. 酶工程 enzyme engineering 应用酶的特异性催化作用制备目标产物的工艺过程优点：酶反应专一，效率高。,.,48,第四节 蛋白质的结构与功能,一、Pr的一级结构与功能的关系1.一级结构不同，生物学功能各异 不同Pr结构间仅有微小的差别就可表现出不同的生物学功能。 加压素（升压、抗利尿）与催产素（子宫平滑肌收缩）均为9肽激素，结构中仅有2个AA有差异。,.,49,2.一级结构中“关键”部分相同，其功能也相同；关键部分变化影响其功能。 来源不同的促肾上腺皮质激素（ACTH），存在结构差异，但在肽链的124位AA残基顺序相同，所以表现出相同的生物学活性。促黑激素（ MSH ）亦是。 说明，其活性仅需所必需的关键部分。3一级结构的变化与疾病的关系 基因突变导致Pr的一级结构改变，使其功能降低或丧失。分子病：分子水平上的改变（碱基突变）而导致的疾病。,.,50,镰刀形红细胞贫血： HbA 肽链（正常） N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-GluC(146) HbS 肽链 N-Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-GluC(146)这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称分子病。,还有糖尿病胰岛素分子病(B链Thr27-Leu),.,51,二、的空间构象与功能的关系,特定空间构象与生物学活性密切相关前体的活化一些蛋白质以无活性的蛋白质原的前体形式分泌合成。经活化后（如酶解部分片段），使活性升高或具有活性。实质是：特定空间构象的形成如：胰岛素前体（胰岛素原）为84个AA残基组成多肽链（猪），活性仅为10%；经酶解生成：肽（29）链（21）链（30），链与链经两对-S-S-连接，即具活性。,.,52,2.Pr的变构现象 一些Pr受某些因素影响，一级结构不变而空间构象变化，导致生物学功能的改变称Pr的别构现象（变构现象） 酶的变构调节，Hb运输O2。,.,53,解释O2与Hb结合的正协同效应的理论：,未结合O2时结构较为紧密，称为紧张态（tense state, T态)，T态与O2的亲和力小。随着O2的结合，4个亚基羧基末端之间的盐键断裂，结构相对松弛，称为松弛态(relaxed state,R态)，R态利于与O2的结合（二、三、四级结构也发生变化） Heme与O2结合使得Fe半径变小，牵动肽段移动，影响其构象，最后使亚基间松弛，有利于进一步结合O2。,.,54,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,.,55,蛋白质构象改变可引起疾病,多肽链的正确折叠对蛋白质正确构象的形成和功能发挥至关重要。 若多肽链折叠发生错误，尽管其一级结构不变，其构象发生改变，仍可影响其功能， 严重时可导致疾病蛋白构象疾病 有些蛋白质错折叠后相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。人纹状体脊髓变性病，老年痴呆症，亨丁顿舞蹈病和疯牛病。,.,56,疯牛病：朊（ruan “软” 音）病毒蛋白prion protein ,PrP（传染颗粒，不含核酸）引起的一组人和动物神经的退行性疾病。,PrPC,PrPSC，聚集，形成淀粉样纤维沉淀,一级结构完全相似,.,57,研究不同来源Pr结构上的差异，是研究生物进化的重要方法。,三、蛋白质结构与生物进化,.,58,第五节 蛋白质的性质,一、Pr分子大小、形状及分子量测定 Pr是一类高分子化合物，分子量1104-106D或更高。 衡量Pr分子形状依据： 根据扩散系数、粘度或其他物理方法推算出Pr的不对称常数。 不对称常数近于1呈球形 不对称常数越大，则分子呈纤维状； 介于之间则为椭圆形。 高分子性质是蛋白质的重要性质，是蛋白质胶体性、变性和免疫学性质的基础。测定蛋白质分子的大小是蛋白质化学的重要内容。,.,59,分子量测定常用方法：1.分子筛层析法： Pr混合物通过一定大小的凝胶介质，大、小分子流程不同而分离。洗脱体积是分子量对数的线性函数。以标准Pr对照，可求出分子量。2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) SDS含丰富的负电荷，与Pr形成复合物后，不同的Pr带有相同的电荷，消除电荷差异使电泳行为只受分子量大小的影响。3.生物质谱 测定分子质量和相对应离子电荷，获得样品的分子量、分子式、分子中放射性核素构成和分子结构。,.,60,二、蛋白质的变性,蛋白质的变性作用：denaturation 物理和化学的因素使蛋白质的空间结构发生改变或破坏，导致其生物学活性丧失，理化性质改变的现象。 1.变性本质：空间构象改变，一级结构不变 次级键破坏,.,61,2.变性作用的特征： （1）结构：蛋白质分子从有规律的紧密结构变为无规则的松散状态。 （2）生物活性丧失：如酶活性，激素作用等等丧失； （3）理化性质改变： 结晶能力丧失；溶解度降低；粘度增加；扩散系数降低。变性后分子结构松散，易为蛋白酶水解。3.变性作用的因素和程度： 物理因素：高温、紫外线、X射线、超声波、剧烈振荡等； 化学因素： 强酸碱、尿素、去污剂、重金属、有机酸、生物碱试剂等 影响次级键的形成与稳定4.变性的意义： 灭菌； 活性蛋白制备需避免变性因素。,.,62,Pr空间结构破坏，一级结构仍存在，功能丧失；恢复空间结构，功能恢复（酶活性）。,.,63,三、蛋白质的两性电离与等电点,AA为两性物质，即可接受质子，又可给出质子（游离氨基羧基，及R基团）； 所以，Pr也是两性物质。 蛋白质的等电点：pI Pr在溶液中带电荷的状态主要取决于溶液的pH。当溶液的pH使蛋白质所带的正负电荷相等，净电荷为零时溶液的pH即为该蛋白质的pI。 蛋白质 酸性AA残基数 碱性AA残基数 pI 胃蛋白酶 37 6 1.0 胰岛素 4 4 5.35 RNA酶 10 18 7.8 细胞色素C 12 25 9.810.8,.,64,体内多数蛋白质的pI为5左右，在生理条件下（pH为7.4）多以负离子形式存在。,.,65,四、Pr的胶体性质,Pr为亲水胶体 具有布朗运动、光散射现象、不透过半透膜以及具吸附力等胶体性质Pr亲水胶体的稳定因素： 1.Pr表面具有水化层 由其表面亲水的极性基团的水合作用，在Pr表面形成较厚的水化层，使Pr分子隔开，阻止其聚集而沉淀。 极性基团：NH3、COO-、CO-NH、OH、SH等2.Pr表面具同性电