原生质体培养和体细胞杂交PPT演示课件

.,原生质体培养和体细胞杂交,.,三个问题,1 . 什么是植物的原生质体？2. 为什么要培养植物的原生质体？3. 怎样进行植物的原生质体培养？4. 什么是体细胞杂交？5. 为什么要进行体细胞杂交？6. 怎样进行体细胞杂交？,.,什么是植物原生质体？,植物原生质体（protoplast）是去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的细胞是植物细胞工程和许多理论研究的理想材料 仍保持植物细胞的全能性 仍能进行植物细胞的各种生命活动是植物遗传转化的理想受体 膜较薄，易从外界摄入DNA、染色体、细胞器、细胞核、甚至 病毒颗粒等,.,原生质体,.,第一节 原生质体的分离与纯化,一、材料的选择1. 几乎植物体的每一部分都可分离得到原生质体2. 叶片、愈伤组织、悬浮培养的细胞都可制备原生质体3. 叶片是最常用的材料4. 一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞培养体系分离原生质体效果较好5.一般选用生长旺盛、生命力强的组织作为分离原生质 体的材料,.,二、材料的预处理(1)暗处理 在分离原生质体前,将在温室内生长5-7周的豌豆枝条取下后,置于维持一定湿度的暗室中预培养1-2天。获得的原生质体存活率较高,并能继续分裂。(2)预培养 把羽衣甘蓝叶撕去下表皮，置于又到愈伤组织的培养基上预培养7天，然后再用酶液脱壁。 得到的原生质体量虽低于未经处理的对照组，但培养时分裂频率提高，并很快形成能生根的愈伤组织,.,(3)预萎蔫 将叶片置于日光或灯光下2-8h使叶片稍萎蔫，则有利于撕除下表皮和酶解叶肉细胞壁分离原生质体。(4)预质壁分离 把材料先放到与酶溶液中糖浓度相同的糖溶液中预培养1h左右，是细胞质壁分离，然后再放入酶液去壁。加快原生质体的释放，提高原生质体的活力。,.,三、分离方法,（一） 机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。,.,（二）酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶Driselase）、果胶酶类（果胶酶和离析酶Macerozyme）、蜗牛酶和胼胝质酶。,.,酶解分离法优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质会影响所获原生质体的活力,.,酶解分离法,.,酶液的配制,使用原则：以用最少的酶制剂种类、最少的量，但能分离得到完整、健康的原生质体为准使用前需要对酶进行纯化在酶液中必须加渗透稳定剂以保护原生质体的活力和质膜的稳定性，一般渗透稳定剂浓度为0.35-0.8mol/L适宜PH：5.4-6.0范围,.,常用的渗透稳定剂,1、糖醇和可溶性糖：包括甘露醇（常用）、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等2、无机盐：CaCl2、MgSO4、KCl、KH2PO4或培养基中的无机盐组成稳定剂中附加钙盐（0.1%）可以增强质膜稳定性；葡聚糖硫酸钾（0.5%-1%）能抑制酶液内某些杂酶和RNA酶的活性，也有助于质膜稳定；加入少量AgNO3能减少酶解时产生的乙烯；加入过氧化氢歧化酶以减轻O2自由基对细胞膜的损伤，从而提高原生质体的植板率,.,（3）分离原生质体,两步分离法（顺序法）： 先用果胶酶使细胞分离，再用纤维素酶解离细胞壁获得原生质体一步分离法（直接法）： 把一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理，目前多用。,.,分离需注意：材料和酶液的体积比： 1:10温度：25-30黑暗或弱光条件一般静置进行，每隔一段时间轻轻摇动几下，也可将培养皿一直放在50r/min的摇床上轻轻振荡来分离原生质体,.,（4）原生质体的纯化,.,离心沉淀法（沉降法） 步骤：将收集的含有原生质体和酶液的滤液低速离心经离心后，原生质体沉降与管底，上部为含碎片的混合液。弃去含杂质的上悬液，重新悬浮原生质体，再次离心，如此重复3次用原生质体培养基洗涤一次，收集管底纯净的原生质体，用培养基调整到一定密度后进行培养优点：操作简便缺点：在制备过程中易造成原生质体的损伤，而且纯度不够好，常存在少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体,.,漂浮法滤液 原生质体漂浮于溶液表面，杂 质下沉到管底 反复离心和重新悬浮2-3次，最后用原生质体培养基洗涤1次后调整到所需密度进行培养。,低速离心,吸出原生质体，转入另一离心管中,.,界面法原理：高分子聚合物混合液产生两相水溶液，通过离心可使原生质体处于两液相的界面之间优点：可获得数量较大的纯净原生质体，同时避免了在收集过程中原生质体因相互挤压而破碎,.,.,（5）原生质体活力的测定,形态识别形态上完整、含有饱满的细胞质、颜色鲜艳的正常球形在低渗的洗涤液或培养液中，分离时被高渗溶液缩小的原生质体又恢复原态胞质内原生质环流或小颗粒内含物的布朗运动程度,.,染色法荧光显微镜识别(FDA法)：FDA (fluorescein diacetate) 本身不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分释放出来。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。,使用浓度：0.01%,.,酚藏花红染色法（0.1%)：酚藏花红能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 伊凡蓝(Evans blue)染色法(0.025%)：有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取。,.,影响原生质体数量和活力的因素1）光:一般在黑暗静止条件下进行.2）温度:酶解温度25-30,兼顾原生质稳定性及酶活性.3）时间:几小时到几十小时,太长影响原生质活力,一般小于24小时,如烟草叶片保温24小时叶肉细胞解离完毕.4）细胞壁降解酶的种类和组合:一般植物细胞使用(纤维素酶0.7-1%,果胶酶0.5-1%),花粉细胞和四分体小孢子,可使用蜗牛酶和胼胝质酶。 5）渗透压的稳定剂种类:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。 6）原生质膜稳定剂 (CaCl2：0.1mM,葡聚糖硫酸钾 0.2-0.3%；葡聚糖硫酸钾0.2%-0.3%)7）pH影响 5.4-6.0,.,第二节 原生质体培养,一、原生质体培养 获得有活力的原生质体后，应用合适的方法，在适当的培养条件下，可使原生质体再生出新的细胞壁，接着细胞进行持续分裂形成细胞团，并培养形成愈伤组织或胚状体，分化或发育成苗，最后形成完整的再生植株。二、原生质体培养的意义建立单细胞无性系用于原生质体融合遗传转化的良好受体多种基础理论研究的实验材料,.,三、原生质体培养方法,.,（一）液体浅层培养,优点：原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。,.,（二）固体平板培养 优点：使原生质体处于固定位置，避免了原生质体的漂浮游动，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。 缺点： 培养基温度对薄层质量和原生质体分布有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。,.,（三）液体-固体双层培养法 优点：固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。 缺点：不易观察细胞的发育过程。,.,四、植株再生过程,植株(原生质体)再生过程是指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和良好的培养条件下，很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分化出完整植株的过程。细胞壁再生细胞分裂植株再生,.,1. 细胞壁再生再生所需时间与植物种类和起源细胞的分化程度及生理状态有关。再生过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，形成多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整的细胞壁。细胞壁再生是细胞分裂的先决条件,.,2. 细胞分裂3. 植株再生 植株再生有两种途径： 通过愈伤组织诱导器官形成途径 通过诱导胚状体途径,.,原生质体的分离培养与植株再生(动画),.,第三节 植物体细胞杂交,体细胞杂交 两种异源（种、属间）原生质体，在人工控制条件下，相互接触从而发生膜融合，胞质融合和核融合并形成杂种细胞的过程。体细胞杂交的意义实现远缘杂交，形成新的物种创造细胞质杂种培育作物新种质和新品种,.,.,一、原生质体融合的类型,（1）自发融合 同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；（2）诱发融合 指将植物原生质体制备出来后，再加入诱导剂或用其他方法促使两亲本原生质体融合的方法。,.,二、原生质体融合的方法,（一）化学诱导融合 利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。1. 无机盐诱导融合法2. 高pH-高Ca2+诱导融合法3. PEG诱导融合法4. PEG-高pH-高Ca2+诱导融合法（二）电诱导融