感染性疾病实验室诊断PPT课件

感染性疾病实验室诊断 Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases,目的要求1掌握感染性疾病常用的实验室检测项目及其临床意义和评价2熟悉引起血流、中枢神经系统、呼吸系统、胃肠道、泌尿系统感染的常见病原体与常见疾病及病原学检查3了解当今感染病的特点、感染类型,第一节 概 述感染性疾病：病原体 宿主 疾病病原体（细菌、真菌、病毒、寄生虫 ）,一、当今感染病的特点1 感染性病原体的种类不断发生变迁2 宿主的免疫防御能力下降3 内源性感染与条件致病菌的感染增加,二、 感染类型（一）按病原体分类 1. 传统病原体感染 细菌： 病毒： 真菌： 寄生虫 2. 新发病原体： SARS冠状病毒 新甲型H1N1流感病毒 高致病性禽流感病毒,(二）按疾病特征分类1. 病原体被清除2. 隐性感染(covert infection)，亦称亚临床感染 一般占人群的90或以上 3. 显性感染(overt infection)又称为临床感染 发病快慢和病程长短：急性感染和慢性感染 感染部位及性质：局部感染和全身感染 全身感染： 菌血症 败血症 毒血症 脓毒血症,(三）按病原体来源外源性感染内源性感染,三、感染性疾病的实验诊断（一）一般实验检测 WBC常规检查 C-反应蛋白（CRP） 血清降钙素原（PCT） 器官功能改变的检测,（二）病原学实验诊断 临床病原体检查目的 明确感染病原体 指导治疗，预防，判断预后,第二节 感染性疾病的常用病原学检测,病原学检测基本程序 正确、规范采集和运送标本 显微镜对标本或组织中的病原体的形态学检查 病原体的分离培养和鉴定 用免疫学技术对病原体抗原或相应抗体的检测 用分子生物学方法对病原体特异性基因的检测,一 、临床标本的采集与处理,（一）标本采集的一般原则 1.早期 病程早期、急性期或症状典型时 使用抗生素前 2.无菌采集 应无污染，严格进行无菌操作 采集的标本均应盛于无菌容器内 3.根据目的菌的特性用不同的方法采集 4.适量标本,不同病程采集不同部位标本 5.安全采集,做好标记,（二）标本的处理,原则：保持病原体活力，保持标本不被污染，也不污染环境1.尽快送检 对环境敏感的细菌应保温立即送检,其他所有采集后最好在2小时内送检,不能及时送检,应注意保存2. 必须注意安全防护,切勿污染环境3.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送,二、 检验方法查病原体：形态与结构检查 分离培养和鉴定检测病原体成分（抗原和核酸）检测患者血清中特异性抗体代谢产物 （生化试验）毒素：外毒素、内毒素,（一）直接显微镜检查（形态与结构检查） 1. 染色标本检查法,染色标本：了解病原体的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体临床意义： 1.镜检可以了解有无病原体及大致的量 2.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原体的初步识别和分类 3.通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有 一定的参考意义 如CSF找到抗酸杆菌，应初步考虑结核分枝杆菌感染,革兰阳性 革兰阴性,抗酸染色,培养在McCoy细胞的沙眼衣原体 吉姆萨染色的McCoy细胞，含大衣原体包涵体，使部分细胞核不清楚。（吉姆萨染色,放大1000倍）,狂犬病毒可于细胞浆中可形成嗜酸性包涵体,新生隐球菌,假丝酵母菌（白色念珠菌）,革兰染色,墨汁负染,2.不染色标本 1) 检查生活状态下细菌的动力及运动状况2） 螺旋体由于不易着色并有形态特征 对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱弧菌 常用方法 压片法(压滴法)或悬滴法 暗视野显微镜或相差显微镜检查,体癣皮屑可见关节孢子,HAV particles found in fecal extracts by immunoelectron microscopy,HAV形态电镜图粪便标本负染 X200000,3. 直接电镜检测EM 免疫电镜技术IEM,（二）分离培养和鉴定,分离培养是微生物学诊断的金标准，是最可靠的传统诊断技术临床意义：1.明确感染病原体2.为临床提供体外抗微生物药物敏 感试验结果,药物敏感试验,标本,培养特征,形态特征,生化试验,血清学试验,毒力试验,普通琼脂平板？血平板？选择培养基？,1. 细菌的分离培养和鉴定,培养特征,细菌学诊断,形态特征,血清学鉴定,大肠埃希菌,对照-,吲哚试验,枸椽酸盐利用试验,大肠埃希菌,甲基红试验,VP试验,大肠埃希菌,大肠埃希菌,对照-,对照+,对照+,生化试验,一）病毒分离培养 1动物接种,（二） 病毒的分离与鉴定,2鸡胚培养,卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种尿囊接种及羊膜腔接种,敏感动物合适部位,3组织细胞培养： 目前培养病毒应用最广的方法 （1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养,识别病毒在培养细胞中增殖 病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变: 细胞病变效应（CPE）、包涵体 2）红细胞吸附（hemadsorption） 细胞病变效应（CPE）： 病毒感染细胞后引起的细胞病变，可出现细胞圆缩、裂解或细胞 肿大、数个细胞融合成多核巨细胞等。,二）病毒鉴定,Cytopathic effect (CPE) of primary severe acute respiratory syndromeassociated coronavirus strain,48h,72h,36h,N,病毒学诊断,常用鉴定试验： 中和实验 血凝抑制实验,virus,红细胞凝集抑制（HI）试验原理： 病毒 病毒（特异性抗体） + + 红细胞 红细胞 凝集 不凝集 血凝现象 血凝抑制现象,Confocal image showing a macrophage in the lung of a mouse infected with SARS-corona virus. Double immunofluorescence labels the macrophage in red with antibodies against Mac-2 and viral protein in green with antibodies against spike.,（三）真菌的分离培养 常用培养基 沙保（Sabourud）培养基 真菌的菌落有两种：酵母型菌落和丝状菌落,酵母型菌落,丝状菌落,新生隐球菌,假丝酵母菌（白色念珠菌）,（三）鉴定,1.糖(醇)类发酵试验 37孵育，观察糖发酵情况。2.同化碳源试验 含菌生理盐水与已融化的固体同化碳源培养基(45)混合，然后在培养基上分别加糖，置25孵育观察结果。若24h后无变化可重复加糖。如能同化周围有生长圈，否则无生长。 3.同化氮源试验 同化碳源试验相同，但需用无氮源的培养基，不要加糖类，而加入硝酸钾。,检测程序,（三）病原体抗原与抗体的检测,病原体抗原成分的检测： 早期诊断 现症感染特异性 IgM： 早期诊断 现症感染特异性 IgG： 双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体现症感染 *排除交叉反应的影响,夹心ELISA( 检测抗原）,间接ELISA ( 检测抗体）,（四）病原体核酸检测,1核酸杂交技术 通过已知序列的探针与病原体的核苷酸杂交，用以了解病原体的有无。Southern印迹杂交（Southern blot） Northern印迹杂交（Northern blot） 斑点杂交（dot blot） 原位杂交（in situ hybridization,ISH） 2PCR扩增病原体微生物特异的DNA或 RNA片段,常用于检测不能在体外培养或目前的培养技术不敏感、 费用高昂或耗时长的病原体,核酸分子杂交(nucleic acid molecula hybridization),genome,probe,32P 35S 3H 125I 生物素 地高辛 酶,genome,genome,genome,probe,probe,probe,检测方法：放射自显影 底物显色 化学发光,2PCR,3. 生物芯片技术,核酸检测结果评价检测病原体微生物最灵敏的方法早期诊断现症感染假阳性与假阴性,（五）细菌毒素的检测 1. 内毒素的测定 常用方法：鲎试验（limulus tests） 内毒素与鲎试剂接触时，可激活凝固酶原，使可溶 性的凝固蛋白原变成凝胶状态的凝固蛋白,内毒素(鲎试剂 ) 凝固酶原 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白(凝胶),2. 外毒素的测定,（1）体内毒力试验 细菌外毒素对机体的毒性作用，可被相应抗毒素中和，若先给动物注射抗毒素，然后再注射外毒素，则动物不产生中毒症状。,（2）体外毒力试验 以细菌外毒素的特异性免疫血清为抗体与被检细菌外毒素(抗原)进行抗原抗体反应，来检测外毒素，从而鉴定细菌是否产生该种毒素。 白喉棒状杆菌的Elek平板毒力测定 （) 免疫学方法：如ELISA法 葡萄球菌肠毒素、肠产毒型大肠埃希菌LT及ST等的测定 （4）分子技术,Elek平板试验,Elek Test,沉淀线(阳性),含白喉抗毒素滤纸片,白喉杆菌菌苔,标准产毒株,(六）体外抗菌药物敏感试验,常用方法纸片扩散法（Kirby-Bauer test）稀释法（dilution test）E试验法（E test） 杀菌试验体外联合药物敏感试验,第三节 常见感染性疾病的实验诊断,一、血流感染（一）引起血流感染常见微生物与常见疾病常见微生物革兰阳性球菌：葡萄球菌、 链球菌、肠球菌革兰阴性杆菌：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌真菌：病毒：HBV、HCV血流感染常见疾病细菌：菌血症、败血症、脓毒血症真菌：真菌血症病毒：病毒血症,(二)血流感染的病原学检查1. 血液标本采集与运送采血时间：寒战或体温高峰到来之前0.51hr 24小时内采集23次采血量：成人510ml，婴儿和儿童为12ml运送：血液置于含抗凝集聚茴香脑磺酸钠无菌瓶中送检,血液标本的采集方法,2、细菌学检验（1）检验程序,blood,aerobic culture,anaerobic culture,Bacteria growth,Bacteria growth,Procedure for bacterial detection in blood,Direct microscopic examination,Culture(BA),colony characteristicsstain of smear and microscopic examinationBiochemical testSerological indentificationantibiotic susceptibility test,Direct microscopic examination,Culture(BA) anaerobic culture,report,First report,Endotoxin detection,（2）临床意义阳性确诊血流感染阴性：培养7天，未见细菌生长注意区分致病菌和污染菌,2、真菌学检验（1）检验程序,blood,aerobic culture,Bacteria growth,Procedure for fungal detection in blood,Direct microscopic examination,Culture(Sabouraud agaror CHROM agar),colony characteristicsstain of smear and microscopic examinationBiochemical testSerological indentificationantibiotic susceptibility test,PNA-FISH PCR,report,First report,Serological detection,（2）临床意义初报：增菌培养真菌孢子终报：分离培养鉴定菌株协助诊断：-D-1,3葡聚糖（BDG ） 半乳甘露聚糖（GM）,二、中枢神经系统感染（一）引起中枢神经系统感染常见微生物与常见疾病常见微生物 脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌 新生隐球菌、假丝酵母菌 乙型脑炎病毒，单纯疱疹病毒中枢神经系统感染常见疾病 脑膜炎 、脑炎、脑脓肿,（二）中枢神经系统感染的病原学检查 1. 标本的采集与运送 脑脊液 临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于无菌容器中 脑脊液应立即保温送检或床边接种，不能暂时保存于 冰箱中,2. 细菌学、真菌学检验（1）检验程序,CSF,Bacteria culture,Procedure for bacterial and fungal detection in CSF,Gram stain,Sabouraud agar,colony characteristicsstain of smear and microscopic examinationBiochemical testantibiotic susceptibility test,report,First report,Make smears(centrifuge),Acid-fast stain,Ink stain,fungal culture,BA, CA, MAC,L-J,（2）临床意义正常脑脊液：无菌直接涂片检查 ：初报 G染色、抗酸染色、墨汁负染色分离培养鉴定：（+）确诊,协助诊断,3、病毒学检查： 抗原抗体 核酸,三、呼吸系统感染（一）引起呼吸系统感染常见微生物与常见疾病 上呼吸道感染： 病毒性感染（主）:鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、 呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒 细菌性感染（20）：白喉棒状杆菌、百日咳鲍特菌 乙型溶血性链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、葡萄球菌 肺部感染： 肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、 铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌、假丝酵母菌、肺炎衣原体、 流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒,（二）呼吸系统感染的病原学检查 1. 标本的采集与运送呼吸道标本类型：鼻咽拭子、痰和经气管采集的标本上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑,2. 细菌学、真菌学检验（1）检验程序,Sputum,bronchal lavage,transtracheal aspirate,Specimen processing,Procedure for bacterial and fungal detection in sputum,bronchal lavage,transtracheal aspirate,colony characteristicsstain of smear and microscopic examinationBiochemical testSerological indentificationantibiotic susceptibility test,report,First report,Eye observation,BA, CA, MAC,L-J, Sabouraud agar,stain of smear and microscopic examination,（2）临床意义肉眼观察痰性状：铁锈色痰 - 肺炎链球菌直接涂片镜检：抗酸杆菌- 结核分离培养鉴定：确诊,3、病毒学检验：分离培养免疫学检测分子技术,四、胃肠道感染（一）引起胃肠道感染常见微生物与常见疾病 胃肠炎、肠炎、结肠炎： 霍乱、伤寒、菌痢 侵袭性：沙门菌、志贺菌、弯曲菌、致病大肠埃希菌、 耶尔森菌、副溶血弧菌 毒素性：霍乱弧菌、致病大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、 产气荚膜梭菌、艰难芽胞梭菌 病毒：轮状病毒 真菌：白色假丝酵母菌、曲霉菌,二）胃肠道感染的病原学检查 1. 标本的采集与运送 粪便标本自然排便，挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检； 液体粪便则取絮状物，一般取13ml 排便困难者，采用直肠拭子采集传染性腹泻应连续送检3次,2、细菌学检验（1）检验程序,Stool,rectal swab,food and water,anaerobic culturemicroaerobic culture,Enrichment broths,SF broth,GN broth,Procedure for bacterial detection in stool,rectal swab,food and water,Wet mountsDirect microscopic examination,colony characteristicsstain of smear and microscopic examinationBiochemical testSerological indentificationantibiotic susceptibility test,report,First report,Isolation culture Selective medium(MAC,SS,TCBS),（2）临床意义直接涂片：一般不做 除外：疑为霍乱弧菌、弯曲菌感染以及肠结核、伪膜性肠炎胃粘膜活检标本： 幽门螺杆菌分离培养鉴定：直接涂片革兰染色菌群调查 ：抗生素相关腹泻细菌毒素检测病毒学检查：,五、泌尿系统感染（一）引起泌尿系统感染常见微生物与常见疾病上尿路感染（输尿管炎、肾盂肾炎）下尿路感染（膀胱炎、尿道炎）大肠埃希菌、变形杆菌、肠球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、铜绿假单胞菌、结核分枝杆菌、假丝酵母菌,二）泌尿系统感染的病原学检查 1. 标本的采集与运送应注意无菌操作取清洁中段尿，排尿困难者可导尿厌氧培养采用膀胱穿刺法、无菌厌氧小瓶运送,2、细菌、真菌学检验（1）检验程序,Clean-catch midstreamurine,stain of