_磷酸盐精确控制策略提升大肠杆菌生长和产物合成效率

田 康 明 ， 尔 昊 ， 路 福 平 ， 王 正 祥摘磷 酸 盐 精 确 控 制 策 略 提 升 大 肠 杆 菌 生 长和 产 物 合 成 效 率*( 天 津 科 技 大 学 生 物 工 程 学 院 工 业 微 生 物 重 点 实 验 室 ， 天 津 300457)要 :磷 酸 盐 是 微 生 物 生 长 代 谢 关 键 物 质 之 一 ， 研 究 发 酵 进 程 中 的 磷 酸 盐 变 化 与 变 化 规 律 及 其 与 特 定 目 标 产 物 合 成效 率 间 相 互 关 系 ， 有 助 于 提 升 微 生 物 的 生 长 和 产 物 合 成 效 率 ， 建 立 新 的 发 酵 控 制 模 式 。 本 文 以 工 业 上 重 要 的 大 肠 杆 菌为 研 究 对 象 ， 研 究 了 发 酵 过 程 中 磷 酸 盐 含 量 变 化 规 律 ， 解 析 了 大 肠 杆 菌 生 长 和 产 酶 过 程 与 磷 酸 盐 消 耗 间 的 关 系 ， 并 通过 调 控 磷 酸 盐 浓 度 提 高 产 酶 水 平 。 通 过 摇 瓶 发 酵 实 验 ， 确 定 了 大 肠 杆 菌 的 磷 酸 盐 耐 受 上 限 为 磷 酸 氢 二 铵 24.0 g /L、 磷酸 二 氢 钾 81.0 g /L， 磷 酸 氢 二 铵 和 磷 酸 二 氢 钾 最 适 初 始 含 量 分 别 为 1.0 g /L、 10.12 g /L， 补 加 方 式 为 :发 酵 培 养 基 中 补 加总 量 的 一 半 ， 剩 余 部 分 发 酵 4 h 后 补 加 。 在 此 基 础 上 ， 大 肠 杆 菌 细 胞 密 度 和 赖 氨 酸 脱 羧 酶 的 比 酶 活 分 别 提 高 了 58.42%和 14.09% 。 研 究 结 果 证 实 通 过 动 态 监 控 并 精 确 控 制 发 酵 过 程 中 磷 酸 盐 的 存 在 量 可 以 有 效 的 提 升 大 肠 杆 菌 的 生 长 代谢 和 产 物 合 成 效 率 。关 键 词 :大 肠 杆 菌 ， 磷 酸 盐 ， 发 酵 ， 控 制 策 略Precise control strategy of phosphate to enhance the cell growthand the efficiency of product synthesis in Escherichia coliTIAN Kang ming， E Hao， LU Fu ping* ， WANG Zheng xiang(College of Biotechnology， Tianjin University of science and technology，Key Laboratory of Industrial Microbiology， Tianjin 300457， China)Abstract:Phosphate is one of the key materials for microbial growth and product synthesis.Thus， systematic studiesof the changes of phosphate， its change rule and the corresponding relationships between the change rule and thesynthetic efficiency of target products help to improve the growth of microorganisms and the efficiency of productsynthesis.This will also establish a novel control mode of fermentation processes.In this paper， industrially importantEscherichia coli was used as a research object to investigate the change rule of phosphate in the fermentationprocess as well as analyze the corresponding relationships between the growth of Escherichia coli， enzymeproduction and phosphate consumption.Subsequently， the production level of lysine decarboxylase was increasedby controlling the concentrations of phosphate. Through shake flask fermentation， the highest concentrations ofdiammonium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate that Escherichia coli cells could toleratewere determined to be 24.00 g /L and 81.00 g /L， respectively.The optimum initial contents of diammonium hydrogenphosphate and potassium dihydrogen phosphate were 1.00 g /L and 10.12 g /L， respectively. Besides， only 1 /2 ofthe total amounts of diammonium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate was added at thebeginning， while the remaining 1 /2 was complemented after 4 hours of fermentation. After cultivated under theoptimized conditions， the cell density of recombinant Escherichia coli and the specific activity of lysinedecarboxylase were increased by 58.42% and 14.09% ， respectively. According to the result， the cell growth andproducts synthesis of E. coli can be improved by dynamic determination and precise control of the phosphateconcentration during the fermentation process.Key words:Escherichia coli;phosphate;fermentation;control strategy中 图 分 类 号 :TS201.3 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1002 0306(2016)01 0184 06doi:10 13386 /j issn1002 0306 2016 01 030收 稿 日 期 :2015 04 27作 者 简 介 :田 康 明 (1985 )， 男 ， 博 士 ， 助 理 研 究 员 ， 研 究 方 向 :工 业 微 生 物 育 种 ， E mail:kangmingtian 。* 通 讯 作 者 :路 福 平 (1967 )， 男 ， 博 士 ， 教 授 ， 研 究 方 向 :酶 工 程 ， E mail:lfp 。基 金 项 目 :国 家 自 然 科 学 基 金 (21446010)。184于微 生物生长繁殖具有重要作用 。无机磷可借助可溶性磷酸盐，被微生物吸收，成为有机磷盐 。 磷还是磷壁 酸、高能磷酸化合物的重要组成部分递能量 ， 使热力学上不利的反应能顺利进行 。磷在微生物生长代谢的 EMP 途径 和 HMP 途径 中酵培养基 组成阶段。如 :谢涛 研究了磷酸盐限量菌的磷酸盐耐受上限件。 同样 ， 钟国 华 、吴学超 、王普 在优化微生磷是微 生物代谢所需的主要元素之一 ， 尤其对 泳仪 北京市六一仪器厂 ;PBl502 S 电子天平 梅 1微生物分解有机物时所产 生的有机酸和 CO2 转化成特勒 托利多 仪器 ( 上海 ) 公司 ;AB204 S分析天平梅特勒 托利 多仪器 ( 上海 ) 公司 ;EHWY2102 恒温 2 。 有机 摇床 上海智诚有限公司 ;HS 1300 V 型超净工作磷在有氧条 件下可以被微生物分解 ， 从而形成磷酸 台 苏州安泰空气技术有限公司 ;SX500 全自动高 压 3 4 灭菌锅 日本 TOMY 公司 ;JY92 DN 超声波细胞 5 8 ， 革兰 氏阳性细菌细胞壁含有大量磷壁酸， 粉碎机 宁波新艺超声设备有限公司 。ATP 作为高能磷酸化合物 的典型代 表 9 11 ， 实质是传 12 实 验 方 法大肠杆菌的磷酸盐耐受上 限实验 在 250 mL 14 15发挥重要 作用。可见 ， 微生物生长过程中磷酸盐的变化情况是监控细胞代谢过程的重要指标 。长期以来 ， 发酵过 程控制参数局限于培养温度、pH、 溶氧水平 、 底物浓度等 。对于磷代谢在发酵控制方面的价值 ， 虽已 有较多研究 ， 但控制策略停留在发 16三角瓶 (50 mL 装液 量 ) 中考察大肠杆菌的磷酸盐耐受上限 。在原始培养基的基础上 ， 磷酸氢二铵和磷酸二 氢 钾 的 添 加 浓 度 分 别 为 2， 6.75、 3， 10.12、 4，13.50、 5， 16.88、 16， 54.00、 18， 60.75、 20， 67.8、 22，74.25、 24， 81.00 g / L， 其余物质种类和含量不变 ， 调节发 酵培养基 pH 至 7.0。 发酵 24 h 后大肠杆菌细胞密度低于正常值 的 25% ， 这时的磷酸盐浓度为大肠杆对胞内磷 积累的影响。随着酵母在富磷培养基 、 低 21 。磷培养基 培养时 ， 胞内磷积累也随之变化。这只是说明限制培养基中的磷浓度是发酵过程中的必要条1.2.2分析大肠杆菌细 胞生长及发酵过程中磷酸盐消耗采用 单因素实验 ， 分别考察磷酸氢二铵和磷 17 18 19物发酵过程 的研究中 ， 也只是简单从宏观上优化了磷酸盐的添 加量 ， 而非精确监控磷酸盐的变化过程来实现研究目的 。本研究通 过对发酵过程中磷酸盐含量的定量检测 ， 系统研究大肠杆 菌细胞生长和产酶过程中磷酸盐的变化及其规律 ， 并通过合理调整磷酸盐的添加方式提升大肠杆菌的生 长效率和产酶水 平 ， 揭示了磷酸盐控制在发酵过程优化与控制中的巨大潜在应用价值 。酸二氢钾 的初始含量对大肠杆菌细胞生长的影响。磷酸氢 二铵初始含量分别选取 0.50、 1.00、 1.50、 2.00、2.50、 3.00、 3.50、 4.00 g / L， 磷酸氢二铵初始含量分别选取 1.69、 3.38、 6.75、 10.12、 13.50 g / L， 其余物质种类和含量不变 ， 调节发酵培养基 pH 至 7.0。并分析其发酵过程中磷酸盐的消耗情况 。1.2.3 分批补加磷 酸盐对大肠杆菌细胞生长的影响采用单因 素实验 ， 分别考察补加时间和补加量对大肠杆菌细胞生 长的影响。补加时间分别选取发酵11.1材 料 与 方 法材 料 与 仪 器大肠杆菌 ( Escherichia coli)42 0#， 保藏于天津科后 2、 4、 6、 8 h;得到最佳补加时间后 ， 补加方式分别选取发酵初始只添 加优化发酵培养基中磷酸盐总量的 1 /2、 1 /3、 1 /4， 发酵到一定时 间后补加余下部分的技大学生物工程 学院酶与应用微生物研究室。该菌 磷酸盐 ， 并分析其发酵过程中磷酸盐的消耗情况 。种为本研究 室前期构建 ， 具有合成赖氨酸脱羧酶的 1.2.4 磷酸盐对大 肠杆菌产酶的影响 分别以原始能力 ， 是工业 上用于高效转化赖氨酸为戊二胺的重组菌 ;氨苄青霉素 ， MES 和磷酸吡哆醛 购自 Sigma公司 ;茚三酮 上海生工生物工程有限公司 ;L 赖氨酸 ， 巯 基 乙 醇 和 SDS Solarbio 公 司 ; 过 硫 酸发酵培养基和优化 发酵培养基在三角瓶中进行发酵实验 ， 诱导产酶后 ， 测其蛋白含量 、 赖氨酸脱羧酶酶活力以及 SDS PAGE 的变化情况 。大肠杆菌发酵液的预处理 :取 50 mL 发酵液于离铵剂Invitrogen 公司 ;其他试剂 均为分析纯化学试;平板培养基 ( g / L) :蛋白胨 10， 酵母粉 5， 氯化钠心管中 ， 6000 r / min 离心 8 min;弃去上清 ， 加入 10 mLddH2 O， 漩 涡 震 荡 混 匀 ， 补 加 ddH2 O 至 30 mL，10， 琼脂 20， pH7.0。 氨苄青霉素 50 g / mL。种子培养基 ( g / L) :蛋白 胨 10， 酵母粉 5， 氯化钠10， pH7.0。原始发酵 培养基 ( g / L) :磷酸氢二铵 2， 磷酸二氢钾 6.75， 柠檬酸 0.85， 硫酸铵 3， 50% 甘油 20 mL，6000 r / min 离心 8 min;弃去上清 ， 加入 10 mL PBS， 漩涡震 荡 混 匀 ， 补 加 PBS 至 30 mL， 6000 r / min 离 心8 min;重复 1 次 ;加入 10 mL PBS 重悬菌体 ， 超声破碎。 (超声破碎条件 :超声 3 s， 间隙 2 s， 温度 25 ，破碎时间 30 min， 功率 40% )。140 g / L 硫酸镁母液 5 mL， 微量元素 1 mL， pH7.0。 1.2.5 磷酸盐含量 的测定 采用磷酸盐快速检测试优化发酵 培养基 ( g / L) :磷酸氢二铵 1， 磷酸二氢钾 10.12， 柠檬酸 0.85， 硫酸铵 3， 50% 甘油 20 mL，140 g / L 硫酸镁母液 5 mL， 微量元素 1 mL， pH7.0。微量 元 素 ( g / L ) : FeSO4 7H2 O 50， 无 水 CaCl27.56， ZnSO4 7H2 O 11.0， MnSO4 4H2 O 1.96， CuSO45H2 O 5.0， ( NH4 )6 Mo7 O24 4H2 O 0.5， Na2 B4 O7 10H2 O0.1。剂盒 ， 来自江苏锐阳生物科技有限公司 。1.2.6 赖氨酸脱羧酶酶活的测定 标准 曲 线 的 绘制 :将 1 g / L 的 L 赖 氨 酸 标 准 品 稀 释 成 100、 200、300、 400、 500 mg / L， 分别取 1 mL 加入到 15 mL 具塞刻度试管中 ， 另取一支试管加 1 mL 水做空白对照 ;每支试管加入 1 mL 茚三 酮溶液 ， 混匀 ， 加上塞子 ;沸水浴 10 min 后放入凉水中冷却 ;每支试管加 8 mL 水3 18k 冷冻离心机 Sigma 公司 ;DYY III6B 电 补齐 10 mL 体系 ;紫外 475 nm 下检测吸光度 。185行 。 以牛血清白蛋白 ( V 部分 )为标准参照 。率为 (7.387 0.241) mg h mL ，单位细胞磷酸盐比表 1 赖 氨 酸 脱 羧 酶 酶 活 反 应 体 系Table 1 eaction system of lysine decarboxylase反 应 体 系空 白 对 照样 品加 入 MES 缓 冲 液( L)300300加 入 发 酵 液( L)5050加 入 Na2 CO3( L)4000加 入 5 g /L L 赖 氨 酸( L)5050加 入 Na2 CO3( L)0400反 应 条 件 37 ， 5 min 37 ， 15 min赖氨酸脱 羧酶酶活测定 :测定赖氨酸脱羧酶酶活反应体系如表 1 所示 ;样品离心后稀释适当倍数，取 1 mL 加入到 15 mL 具塞 刻度试管中 ， 另取一支试管加 1 mL 水做空白对照 ;每支试管加入 1 mL 茚三酮溶液 ， 混匀 ， 加上塞子 ;沸水浴 10 min 后放入凉水中冷却 ;每支试管加 8 mL 水补齐 10 mL 体系 ;紫外475 nm 下检测吸光度 。赖氨酸脱羧酶酶活的定义 :37 ， pH6.5， 反应15 min， 每消耗 100 mg / mL 赖氨酸定义为 1 个酶活单位。赖氨 酸 脱 羧 酶 比 酶 活 的 定 义 : 细 胞 破 碎 液 中1 mg 蛋白所对应的 赖氨酸脱羧酶酶活定义为 1 个比酶活单位 。1.2.7 蛋白浓度的测定 按照文献介绍的方法进 201.2.8 细胞密度的 测定 取适量发酵液经过适当稀释 ， 使测定的 吸光度值在 0.1 0.8 范围内 ， 再使用紫外分光 光度计 ， 于波长 600 nm 处测定吸光度 ， 所测得结果即为大肠杆菌的细胞密度 。1.3 数 据 统 计 分 析利用 OriginPro 8.0 进行数据统计分析 。图 1 随 着 磷 酸 氢 二 铵 和 磷 酸 氢 二 钾 含 量 的增 加 对 大 肠 杆 菌 生 长 情 况 的 影 响Fig.1 Effects of the increasing concentrationsof diammonium hydrogen phosphateand potassium hydrogen phosphateon the growth of Escherichia coli注 : W1: ( NH4 )2 HPO4 2 g /L， KH2 PO4 6.75 g /L; W2:(NH4 )2 HPO4 3 g /L， KH2 PO4 10.12 g /L;W3:( NH4 )2 HPO44 g /L， KH2 PO4 13.50 g /L; W4: ( NH4 )2 HPO4 5 g /L，KH2 PO416.88 g /L; W5: ( NH4 )2 HPO4 16 g /L， KH2 PO454.00 g /L; W6: ( NH4 )2 HPO4 18 g /L， KH2 PO4 60.75 g /L;22.1结 果 与 分 析大 肠 杆 菌 培 养 中 磷 酸 盐 添 加 极 限了解大肠 杆菌对磷酸盐添加极限的要求 ， 对后W7: ( NH4 )2 HPO4 20 g /L， KH2 PO4 67.8 g /L; W8:(NH4 )2 HPO4 22 g /L， KH2 PO4 74.25 g /L;W9:( NH4 )2 HPO424 g /L， KH2 PO4 8100 g /L。续研究磷酸盐的若干作用以及新工艺路线的形成至关重 要 ， 结果如图 1 所示。发酵 24 h 后大肠杆菌发酵液吸 光度 A600 的正常值为 1.383 0.068， 而当磷酸间单位体积菌体平均生长速率为 (1.893 0.115) 10 3 h 1 mL 1， 单位时间单位体积磷酸盐平均消耗速 1 1氢二铵添加 量达到 24.00 g / L 和磷酸氢二钾的添加 表 2 磷 酸 氢 二 铵 的 初 始 含 量量达到 81.00 g / L 时 ， 发酵 24 h 发酵液吸光度 A600 为0.321 0.015 低于正常值的 25% ， 此即为大肠杆菌细胞对磷酸盐的耐受上限 。2.2 大 肠 杆 菌 细 胞 生 长 及 发 酵 过 程 磷 酸 盐 的 消 耗对 大 肠 杆 菌 发 酵 过 程 中 磷 酸 盐 消 耗 情 况 的 影 响Table 2 Effects of initial contents of diammonium hydrogenphosphate on phosphate consumption duringthe fermentation process of E.coli特 征培养基磷 酸氢二铵 、 培养基磷酸二氢钾的初始含量对大 肠杆菌细胞 生 长 的 影 响 分 别 如 图 2、 3 所示。 随着初 始磷酸氢二铵含量的增加 ， 大肠杆菌细胞密度 呈现先上升然后下 降 接 着 上 升 再 下 降 的 趋势。当初始磷酸氢二铵含量为 1.00 g / L 时 ， 最有利于菌 体 生 长 ， 此 时 大 肠 杆 菌 发 酵 液 吸 光 度 A600 为1.143 0.011。随着初始磷酸二氢钾含量的增加 ， 大肠杆菌细胞密度 呈现先上升再降低的趋势。当初始磷酸 二氢钾含量为 10.12 g / L 时 ， 最 有 利 于 菌 体 生长 ， 此时大肠杆菌 发酵液吸光度 A600 为 1.450 0.002。其发酵过程中磷酸盐消耗情况分别如表 2、 3 所示。当初始磷酸氢二铵 含量为 1.00 g / L 时 ， 大肠杆菌单位时186磷 酸 氢 二 铵始 含 量(g L 1)2.02.53.03.54.01.51.00.5单 位 时 间 单 位 单 位 时 间 单 位 单 位 细 胞体 积 菌 体 平 均 体 积 磷 酸 盐 磷 酸 盐 比生 长 速 率 平 均 消 耗 速 率 消 耗 率(10 3 h 1 mL 1) (mgh 1 mL 1) (10 2 g 1细 胞 )1.787 0.045 6.663 0.293 7.560 0.2651.380 0.142 7.093 0.110 9.553 0.1050.084 0.035 7.143 0.042 17.743 0.1151.627 0.166 7.607 0.180 9.490 0.1561.380 0.151 6.813 0.124 9.213 0.1251.497 0.136 7.317 0.038 9.453 0.1921.893 0.115 7.387 0.241 8.080 0.0531.540 0.170 7.003 0.097 9.220 0.104消耗率为 (8.080 0.053) 10 g 细胞。 当初始磷酸率为 12.990 0.138 mg h mL ，单位细胞 磷 酸 盐比消耗率为 (11.153 0.162) 10 g 细胞 。 2 1二氢钾含量为 10.12 g / L 时 ， 大肠杆菌单位时间单位体积 菌 体 平 均 生 长 速 率 为 ( 2.507 0.134 ) 10 3 h 1 mL 1， 单 位时间单位体积 磷酸盐平均消耗速 1 1 2 1示。 随着补 加 磷 酸 氢 二 铵 和 磷 酸 二 氢 钾 时 间 的 推迟 ， 大肠杆 菌细胞密度与不补加磷酸盐时相比呈现先上升再降低的趋势。在发酵 4 h 后补加磷酸氢二铵和 磷酸二氢钾最有利于菌体生长 ， 发酵 12 h 后大肠杆菌发酵液吸光度 A600 为 2.203 0.016。 随着发 酵4 h 后补加磷酸氢二铵和 磷酸二氢钾含量的增加 ， 大肠杆菌细胞密度 呈现下降的趋势。发酵初始只添加优化发酵培养基中 磷酸氢二铵和磷酸二氢钾含量的1 /2， 发酵 4 h 后补加剩余的 1 /2 磷酸氢二铵和磷酸二氢 钾最有利于菌体生长 ， 发酵 12 h 后大肠杆菌发酵液吸光度 A600 为 2.191 0.008。 2、 4、 6、 8 h 发酵过程中磷酸盐消耗 情况如图 5 所示。其大肠杆菌发酵过程 中 磷 酸 盐 消 耗 率 分 别 为 57.20% 、 46.62% 、50.06% 、 38.19% 。发酵 4 h 后补加 1 /2、 2 /3、 3 /4 发酵过程中磷酸盐 消耗情况如图 7 所示。其大肠杆菌发酵过 程中磷酸盐消耗率分别为 57.10% 、 21.43% 、图 2 磷 酸 氢 二 铵 的 初 始 含 量 43.20% 。对 大 肠 杆 菌 细 胞 生 长 情 况 的 影 响Fig.2 Effects of initial contentsof diammonium hydrogen phosphateon the growth of Escherichia coli cellsFig.3图 3磷 酸 二 氢 钾 的 初 始 含 量对 大 肠 杆 菌 细 胞 生 长 情 况 的 影 响Effects of the initial contents of monopotassiumphosphate on the growth of E.coli cells表 3磷 酸 二 氢 钾 的 初 始 含 量图 4不 同 时 间 补 加 磷 酸 氢 二 铵 和 磷 酸 二 氢 钾 的大 肠 杆 菌 细 胞 生 长 情 况 对 比Fig.4 Comparisons of the growthof E.coli cells after the addition of diammonium hydrogenphosphate and potassium dihydrogen phosphate at different times对 大 肠 杆 菌 发 酵 过 程 中 磷 酸 盐 消 耗 情 况 的 影 响Table 3 Effects of initial contentsof monopotassium hydrogen phosphateon phosphate consumption during fermentation process of E.coli磷 酸 二 氢 钾含 量(g L 1)6.751.69单 位 时 间 单 位 单 位 时 间 单 位 单 位 细 胞 磷 酸体 积 菌 体 平 均 体 积 磷 酸 盐 盐 比 消 耗 率生 长 速 率 平 均 消 耗 速 率 2 1(10 g 细 胞 )(10 3 h 1 mL 1) (mgh 1 mL 1)1.857 0.076 8.463 0.200 9.223 0.2901.577 0.114 3.793 0.127 4.990 0.118图 5 发 酵 2、 4、 6、 8 h 后 补 加 磷 酸 盐 大 肠 杆 菌 发 酵 过 程 中磷 酸 盐 消 耗 情 况 对 比Fig.5 Comparisons of phosphate consumption duringthe fermentation process of E.coliwith the addition of phosphate after 2， 4， 6 and 8 h3.38 1.537 0.197 6.253 0.078 7.827 0.14210.12 2.507 0.134 12.990 0.139 11.153 0.16213.50 2.213 0.086 9.873 0.293 9.280 0.2422.3 分 批 补 加 磷 酸 盐 对 大 肠 杆 菌 细 胞 生 长 及 发 酵 过程 中 磷 酸 盐 消 耗 的 影 响磷酸氢二铵和磷 酸二氢钾的补加时间和补加比例对 大肠杆菌细胞生长的影响分别如图 4、 图 5 所本研究选择磷酸氢二铵和磷酸二氢钾两种磷酸盐进行研究 :首先 ， 磷酸氢二铵具有含氮磷两种营养成分的特点 ， 在微生物培养基中为菌体提供磷酸根的同时也提供了 一定量的氮源 ;其次 ， 考虑到每摩尔磷磷酸氢二铵和酸 二氢钾均可提供等摩尔的磷酸根离子 ;最后 ， 这两种 磷酸盐是微生物培养基中常用的两种无机盐添加物 。187长代谢速 率加快，进而有利于产物的形成玲等 通过响 应面的方法，虽然对磷酸盐的含量进达量均有了显著提高 。图 6 磷 酸 氢 二 铵 和 磷 酸 二 氢 钾 的 不 同 补 加 比 例对 大 肠 杆 菌 细 胞 生 长 情 况 的 影 响图 9 原 始 发 酵 培 养 基 和 优 化 发 酵 培 养 基 诱 导 产 酶 后SDS PAGE 对 比Fig.6Effects of the ratios of diammonium hydrogen phosphateFig.9 SDS PAGE analysisto potassium dihydrogen phosphate on the growth of E.coli cells of the proteins in the originaland optimized fermentation media after inductionM:protein marker;1:空 白 对 照 ;2:原 始 发 酵 培 养 基 ;3:优 化 发 酵 培 养 基 。 22 。王建 23行了优化 ， 使赖氨酸脱羧酶的酶活得到了提高。但只是从宏观 角度进行的研究 ， 而本实验对微生物发酵过程中的 磷酸盐含量进行了精确控制 ， 连续监控微生物生长 过程中磷酸盐的消耗情况 ， 并找到微生物发酵过程中磷酸盐最适的补加时间和补加量 。图 7 发 酵 4 h 后 补 加 1 /2、 2 /3、 3 /4 磷 酸 盐 的发 酵 过 程 中 磷 酸 盐 消 耗 情 况 对 比3 结 论本实验通过对发 酵过程中磷酸盐含量变化的检Fig.7 Comparisons of phosphate consumption duringthe fermentation process with the additionof 1 /2， 2 /3， 3 /4 phosphate after 4 h测 ， 实现大肠杆菌 工程菌株的高密度培养 ， 进而提高赖氨酸脱羧酶酶 活和产酶量。对摇瓶发酵工艺进行优化 :大 肠 杆 菌 的 磷 酸 盐 耐 受 上 限 为 磷 酸 氢 二 铵2.4 磷 酸 盐 对 大 肠 杆 菌 产 酶 水 平 的 影 响 24.0 g / L、 磷酸二氢钾 81.0 g / L。 当磷酸氢二铵的初始原始发酵培养基 和优化发酵培养基的培养条件下 ， 诱导产酶后 ， 其 赖氨酸脱羧酶的酶活力对比结果如图 8 所示。 原始发酵培养基的培养条件 下 ， 赖氨酸脱羧酶的比酶活为 78.75 U / mg， 优化发酵培养基的培养条件下 ， 赖氨酸脱羧酶的比酶活为 89.85 U / mg， 增 长了14.09% 。 SDS PAGE 的结果如 图 9 所示。从该图可以看出 ， 在优化发 酵培养基的培养条件下 ， 蛋白的表含量为 1.0 g / L， 磷酸二氢钾的初始含量为 10.12 g / L，磷酸盐 采取补加的方式 对 大 肠 杆 菌 进 行 发 酵 培 养时 ， 可以 实现大肠杆菌的高密度培养。通过发酵过程中磷酸盐 含量的精确控制 ， 使大肠杆菌工程菌株的发酵液吸光度 A600 增长了 58.42% ， 在此基础上 ， 赖氨酸脱 羧酶酶活增加了 91.20% 。基于以上研究结果 ， 可进一 步通过监控发酵生产过程中磷酸盐含量变化趋势 ， 优化工 业发酵过程 ， 并进行更大规模发酵生产 ， 提高产物合成水平 ， 为工业化生产奠定基础 。参 考 文 献 1 Anandan P， Parthipan G， avi G， et al. 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Effects of atmospheric CO2enrichment and sunlight on degradation of plant particulate and图 8 原 始 发 酵 培 养 基 和 优 化 发 酵 培 养 基 诱 导 产 酶 后赖 氨 酸 脱 羧 酶 的 比 酶 活 对 比dissolved organic matter and microbial utilization J .Archiv FurHydrobiologie， 2005， volume 162(3):287 308(22).Fig.8 Comparisons of the specific enzyme activities 3 何 燧 源 ， 金 云 云 ， 何 方 .环 境 化 学 (第 三 版 ) M .上 海 :华 东of lysine decarboxylase in the originaland optimized fermentation media after induction优化培养 基中的磷酸盐含量后 ， 使微生物的生理 工 大 学 出 版 社 ， 2000， 96 106. 4 喻 林 主 编 .水 质 监 测 分 析 方 法 标 准 实 务 手 册 M .北 京 :中国 环 境 科 学 出 版 社 ， 2002:332.188 5 Forster B M， Marquis H.Protein transport across the cell wallof monoderm Gram positive bacteria J .Mol Microbiol， 2012， 84(3):405 413. 6 Marcus I M， Bolster C H， Cook K L， et al. 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