生化解说PPT演示课件

BiochemistrySixth Edition,Chapter 7Hemoglobin:Portrait of a Protein in Action,Copyright 2007 by W. H. Freeman and Company,Berg Tymoczko Stryer,.,1,在血管中，红细胞将肺部氧气运送到需要氧气的组织。血红蛋白有四个亚基，每个亚基有一个结合氧的色素基团（即血红素）。血红素使红细胞具有红色，能够根据需要运输和释放氧气。血红蛋白是空间结构明了的首例蛋白质之一。上图的右边是血红蛋白一个亚基的折叠结构。,.,2,有氧代谢能获得更多的能量，因此从厌氧代谢转变成有氧代谢是一个巨大的进步。脊椎动物获取氧气的方式有两种：即用循环系统将氧气输送到全身和采用血红蛋白运氧和肌红蛋白储氧。红细胞的血红蛋白能够将肺部氧气运送到各个组织，并将各组织的CO2和H+运回肺部。位于肌肉的肌红蛋白是氧气储存蛋白，能及时提供肌肉需要的氧气。 肌红蛋白和血红蛋白进化相关，结合氧的结构几乎一致。但是血红蛋白携带氧的能力大，能够达到90%的潜在氧容量。在相似的条件下，肌红蛋白质能实现其潜在氧容量的7%。这种巨大差异的原因何在？,.,3,肌红蛋白是单链多肽，而血红蛋白有4条多肽链。血红蛋白四条多肽链结合氧是协同进行的，即一个亚基与氧结合能够增加同一蛋白其余三个亚基结合样的能力。而且，血红蛋白结合氧的能力还受到结合的CO2和H+的调节。氧结合的协同性和受CO2和H+的调节性使血红蛋白在不同组合的结合状态能改变血红蛋白的三维结构。 这些蛋白是首例用x-射线晶体图谱解析三维结构的蛋白质。蛋白质序列变异导致疾病的概念是从镰刀型贫血病研究提出的。血红蛋白研究给生物化学提供了很多内容，包含血红蛋白自身的生物化学和血红蛋白作为原型研究其它蛋白质的内容。,.,4,图7.1鲸鱼肌红蛋白的三维结构（测定的第一个蛋白质）。1950年代，John Kendrew的x-射线晶体研究确定该蛋白质的结构。肌红蛋白的a-螺旋多，螺旋间用拐弯连接形成球状结构。有一个氧结合位点。,.,5,肌红蛋白有氧结合状态(oxymyoglobin)或无氧状态（deoxymyoglobin）。肌红蛋白结合氧的能力依赖于血红素辅基。血红素辅基使血液和肌肉显红色。血红素是有机分子，中央是铁原子。这个有机分子叫原卜啉，四个卜啉环之间用次甲基连接起来形成四卜啉环。卜啉环上连有四个甲基、两个乙烯基、和两个丙酸基团。铁原子处于原卜啉的中央。铁原子与四个卜啉环的氮原子结合。,.,6,铁原子是Fe2+。在血红素平面的两侧，铁离子还能形成第五和第六配位键。第五配位点被蛋白质近位组氨酸（proximal histidine）的咪唑环占居。脱氧状态第六配位点空余，铁离子比卜啉环中央孔大，无法嵌入中央孔，处于卜啉环平面外0.4A处（左边）。氧分子与铁离子第六配位点结合导致铁的电子云发生重排，铁离子比原来的直径小，能够移入卜啉环平面中央孔内（右边）。,.,7,铁离子电子结构的改变伴随着磁性的改变，成为功能性磁共振成像（fMRI）的基础。1936年Linus Pauling基于磁性测量就预测出氧结合导致结构改变，比这类蛋白三维结构阐明时间早25年。,肌红蛋白结构阻止活性氧释放,氧与血红素铁离子结合使铁离子的电子向氧偏移。三价铁离子（Fe 3+）与超氧阴离子（O2-）形成的复合物（图7.3）能很好解释其结构。但离去氧是氧气，不是超氧离子。首先释放超氧离子是活性氧，毒性大会破坏很多物质；其次，释放超氧离子使铁离子处于三价状态，即正铁肌红蛋白（metmyoglobin），不能再结合氧，丧失了储氧功能。,.,8,结合口袋还有一个远端组氨酸提供氢键供体、与氧形成氢键。结合氧的超氧特性强化了这种相互作用。因此肌红蛋白的蛋白质部分控制血红素活性，使之更适于与氧可逆性结合。,.,9,血红蛋白是四个亚基组合而成的蛋白质 在肌红蛋白三维结构确定不久，Max Perutz 就解析出马血红蛋白的三维结构。自此之后，很多血红蛋白的三维结构被确定。这些血红蛋白分子有四条多肽链，两个多肽链叫a-链，另两个多肽链叫b-链。每个亚基的a-螺旋排列与肌红蛋白的a-螺旋排列完全相同。蛋白质结构是球状。在鲸鱼及红蛋白和人血红蛋白之间，a-链有25%的一致性，b-链有24%的一致性。关键残基，包括近端组氨酸和远端组氨酸，都高度保守。因此，蛋白质的a-链和b-链相互之间，以及这些多肽链与鲸鱼肌红蛋白之间发生了差异进化。,.,10,图7.5 脱氧血红蛋白的四级结构。血红蛋白有两个a-链和两个b-链，成ab-二聚体发挥作用。（A）绸缎示意图。（B）空间填充模型。血红蛋白四聚体也叫血红蛋白A（HbA）。这种四聚体更恰当地描述成一对ab-二聚体结合构成的四聚体。在脱氧状态，这些ab二聚体界面间相互结合广泛，包括C-端的相互结合。四聚体中血红素是相互分开的，铁原子之间的距离达24 40 A。,.,11,蛋白质结合氧的饱和度对氧浓度作图。饱和度Y是已结合的氧的个数与可能的氧结合位点之间的比值。氧气浓度用氧分压pO2表示。肌红蛋白的氧结合曲线就是简单的化学平衡(图7.6)。氧结合曲线随pO2增加急剧升高，随后达到平台。结合一半饱和度的pO2值是2 torr（mm Hg）。,.,12,血红蛋白结合氧的曲线具有一些显著特征（图7.7）。这种曲线与肌红蛋白的简单平衡曲线不同，与“S形很相似。因此血红蛋白的氧结合曲线呈S曲线。结合氧的能力比肌红蛋白弱。一半结合位点结合氧的浓度达到26 torr。,.,13,.,14,S型结合曲线表明蛋白质结合氧具有协同性。一个位点结合氧分子将增加其它空余位点结合氧的能力。相反，一个位点释放氧分子将增加其它位点排出氧分子的能力。这种结合行为叫协同性， 血红蛋白结合氧的协同性的生理意义：氧必须在血液中从肺部（相对压强是100 torr）运输到代谢活跃的组织（氧分压很低，典型的数据是20 torr）。S型曲线的协同行为能够有效地运输氧（图7.8）。在肺部，氧结合血红蛋白达到98%的饱和度。进入组织血红蛋白结合氧的饱和度就跌至32%，即释放了66%的氧气（98% - 32% = 66%）。协同性释放有助于血液在组织更完全地释放氧气。如果采用肌红蛋白运输氧气，在肺部98%的氧结合位点结合氧，但是在组织还有91%的位点处于氧结合状态，即只有7%的结合位点运输氧气。因此肌红蛋白结合氧的能力太强而不适于承担运氧功能。如果蛋白没有协同性，从100 torr的氧分压环境到达20 torr的氧分压环境，只有38%的氧结合位点运送氧（63% - 25% = 38%）。因此血红蛋白的协同性结合和释放氧气使血红蛋白运氧能力大大提高。,.,15,图7.8 协同性促进血红蛋白的运氧能力。,肺部血红蛋白与氧结合达到98%的饱和度。进入组织血红蛋白结合氧的饱和度降至32%，能释放66%的氧气（98% - 32% = 66%）。肌红蛋白在肺部98%的位点结合氧，但在组织还有91%的位点结合氧，只释放7%位点结合的氧气。若血红蛋白没有协同性，氧分压从100 torr到20 torr只有38%的结合位点运送氧（63% - 25% = 38%）。,.,16,休息状态肌肉的氧浓度是40 torr，血红蛋白能释放21%结合位点的氧（虽然氧分压降低了60 torr）。运动状态肌肉的氧浓度只有20 torr，血红蛋白能释放66%结合位点的氧。从40 torr的氧分压至20 torr氧结合曲线最陡峭，因此在组织最需要的时候能有效地供应氧。,.,17,血红蛋白结合氧导致四级结构改变，即a1b1二聚体和a2b2二聚体之间旋转15度。二聚体内部没有变化（仅仅是二聚体之间发生移动）。结果，两个二聚体之间的界面受到很大的影响。氧结合后血红蛋白两个二聚体之间的自由度比脱氧血红蛋白高。,.,18,为了解释配体与多亚基蛋白质之间的结合特性， Monod, Wyman, 和Changeux提出协同模型，即MWC模型。假定多亚基蛋白质有两个结构状态，即T态和R态。配体与多亚基蛋白的结合导致四聚体向R态转变。结合愈多，转变的的可能性愈大。氧气浓度低，多数蛋白质处于T态，与氧的结合能力差。氧浓度愈高，R态愈多，结合力愈强，曲线陡峭。当所有位点都结合氧，结合曲线回复成平坦，导致血红蛋白结合氧呈“S”型曲线，,.,19,图7.12 T到R的转化。血红蛋白的氧结合曲线可以视为所有蛋白质都是T型的结合曲线和所有蛋白质都是R型的结合曲线的综合。由于氧分子的结合导致T型向R型转化，氧结合曲线变成S形。,.,20,在协同模型中，每个四聚体只能选取全是R型或全是T型之一。还有一种模式，即序变模型，配体与一个位点结合只增加相邻位点的结合亲和性，不会导致蛋白质一次性地将T型转变成R型（图7.13）。没有一种模式能彻底解释血红蛋白的氧结合行为。实际上，需要将两种模式综合才能解释。血红蛋白三个位点都结合氧分子时，表现为协同模型（此时四聚体结构呈全R态），剩下的结合位点与氧气的亲和力比全T模型的氧亲和性高20倍。但是，血红蛋白氧结合行为又不全是协同模式。如果四聚体只有一个位点结合氧，四聚体主要是T态，但此时的血红蛋白结合氧的亲和性相当于全是T态的脱氧血红蛋白的3倍。从这个角度看，其行为呈序变模式。这些结果表明协同模型和序变模型是理想情况。,.,21,血红素结构变化传递到a1b1和a2b2界面。一个位点与氧结合导致T和R型结构之间的平衡发生转化的机制。一个亚基与氧结合导致铁原子从卜啉环平面外侧移入卜啉环平面内部。铁原子移动导致第五配位键的邻近组氨酸移动。而该组氨酸是一个a-螺旋的一部分，,这个a-螺旋也跟着移动。这个螺旋的C-端处于两个ab-二聚体之间的界面，此螺旋C-端位置的变化有利于T态向R态转化。结果，一个亚基铁原子移位直接传递到其它亚基。二聚体界面的重排提供了亚基之间通讯的途径，导致氧结合具有协同性。,.,22,红细胞的2,3-二磷酸甘油酸是影响血红蛋白氧亲和性的关键,为了让血红蛋白有效地发挥作用，需要血红蛋白在T-型稳定，直到体内有足量氧气与血红蛋白结合才转化成R-型。但是T-型血红蛋白很不稳定，生理条件下少量氧气就能将T-型转化成R-型。比较纯化血红,蛋白和红细胞血红蛋白的氧结合性质，发现红细胞稳定血红蛋白T-态结构的机制。纯化血红蛋白结合氧的亲和性比红细胞高。这种差异的基础是细胞含有2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG）。红细胞的2,3-BPG含量与血红蛋白含量几乎相当（约2 mM）。这个化合物含有很多阴离子。没有2,3-BPG，血红蛋白运输氧的能力很差，在组织只能释放8%的氧气。,.,23,图7.15 纯化的血红蛋白和红细胞的血红蛋白结合氧的情况。纯化血红蛋白结合氧的亲和性与红细胞血红蛋白结合氧的亲和性大。这种差异的基础在于红细胞含有2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG）。,.,24,2,3-BPG显著降低血红蛋白的氧亲和性的机理： T-态血红蛋白中心有一个口袋能够结合2,3-BPG，结合后T态更稳定。 T-态转化成R-态，这个口袋就崩溃， R-态没有这个口袋，释放2,3-BPG。在2,3-BPG存在时，血红蛋白四聚体需要更多位点与氧结合才能破坏2,3-BPG与蛋白的相互作用，将T-态转化成R-态。,.,25,别构效应剂：2,3-BPG与氧气没有任何相似之处，因此2,3-BPG结合位点与氧气结合位点完全不同，这类效应剂叫别构效应剂（allosteric effector）。2,3-BPG的其它生理意义。胎儿血红蛋白是两个a链和两个g链构成的四聚体（与成人不同）。g链与b链一致性达72%，其中His143变成Ser143，因此蛋白质与2,3-BPG结合力大大降低，使胎儿血红蛋白结合氧的亲和性比成年人血红蛋白结合氧的亲和性高（图7.17），母体红细胞结合氧气能被有效地运送到胎儿红细胞。,.,26,图7.17 胎儿红细胞的氧亲和性。由于胎儿红细胞的血红蛋白不结合2,3-BPG，胎儿红细胞对氧的亲和性比母体红细胞高。,.,27,.,28,7.3 H+和CO2促进氧气释放：Bohr效应 血红蛋白所携带的氧气在最需要氧气的组织（氧分压低）能协同性释放。血红蛋白应答需氧的其它环境信号能加强这种协同能力。快速代谢组织，例如收缩肌肉，产生大量的H+和CO2。血红蛋白发生进化，H+和CO2浓度愈高，血红蛋白释放O2愈多。如同2,3-BPG，H+和CO2也是血红蛋白的别构效应剂，其结合位点与氧结合位点不同。在Christian Bohr于1904年发现这一现象之后，H+和CO2对血红蛋白结合氧的调节称为Bohr效应。,.,29,血红蛋白结合氧的亲和性随pH值从7.4降低而下降（图7.18）。当血红蛋白进入pH值低的区域，血红蛋白释放氧的能力提高。例如肺部pH值是7.4，氧分压是100 torr，而运动肌肉的pH值是7.2，氧分压是20 torr，血红蛋白能够释放77%的氧气。如果pH值没有改变，血红蛋白只能释放66%的氧气。,图7.18 pH对血红蛋白氧亲和性的影响。pH从7.4（红色）降至7.2（蓝色）导致氧合血红蛋白释放氧气。,.,30,pH效应的化学基础：在脱氧血红蛋白中，b146His （C-端）的羧基与另一ab二聚体的a链Lys40形成盐键，锁定b146组氨酸与同一链的b94 Asp相互作用形成盐键。这些盐键的形成稳定了蛋白质的T-态结构，使蛋白质释放氧气的能力更大。pH值高，b链的b146氨基酸侧链没有质子化，不能形成盐键。pH值降低，b146氨基酸侧链质子化，与b94位天冬氨酸形成盐键，稳定T-态结构。,.,31,CO2是能够穿过红细胞膜的中性物质。红细胞膜的运输蛋白（包括与Rh血型结合的蛋白质）有助于CO2的跨膜运输。CO2刺激血红蛋白释放氧气。,.,32,.,33,CO2刺激血红蛋白释放氧气的机制有两种。第一，胞内CO2浓度过高导致红细胞内pH值降低（图7.20）CO2与水结合形成碳酸。这个反应受碳酸脱水酶促进。碳酸的pKa值是3.5，因此一旦形成碳酸，碳酸将解离成HCO3-和H+，导致pH值降低。pH值降低会稳定血红蛋白T-态结构，促进血红蛋白释放氧气。,.,34,第二种机制是CO2直接与血红蛋白相互作用刺激血红蛋白释放氧气。在同一pH值时， CO2对血红蛋白结合氧的影响见图7.21。有CO2时，pH7.2氧分压达40 torr血红蛋白能够能够释放90%的氧。CO2与血红蛋白N-端氨基反应形成羧胺，将N-端带正电荷或中性的氨基转化成带负电荷的胺羧基。多肽链的N-端处于两个ab二聚体界面，带负电荷的N-端参与盐键形成稳定血红蛋白的T-态结构，有利于氧气释放。这个过程不仅有利于氧气释放，还能运输CO2。实际上有14%的CO2是利用血红蛋白运输的。,.,35,红细胞释放的CO2大多数是以HCO3-形式（在红细胞内CO2被转化成碳酸）在肺部释放（图7.22）。红细胞膜上特殊的运输蛋白将细胞内HCO3-与细胞外的Cl-交换，将红细胞内大多数HCO3-运出。用这种方式将高浓度CO2以HCO3-形式从组织运到肺部。在肺部，HCO3-又逆转生成CO2，以气体的形式从肺部呼出。因此，组织产生的CO2导致红细胞pH值降低促进血红蛋白释放氧气，而CO2自身转变形式在血浆运输、在肺部释放。,.,36,1949年Linus Pauling在研究镰刀性贫血病时提出分子有缺损会致病。这个概念比Watson和Crick提出DNA双螺旋模型早4年。患者红细胞在缺氧时形成镰刀状（图7.23）。Pauling提出这