微孔膜过滤技术

0微孔膜过滤技术摘要本文介绍了微孔滤膜的种类、微孔过滤膜的性质及检测、微孔过滤膜设备及其注意事项以及微孔过滤膜技术在生物化学和制药工业中的应用。关键词：微孔滤膜；过滤技术； 应用目录第一章 前言 .1第二章 微孔过滤膜 .12.1 微孔滤膜的优点及种类 .12.2 微孔滤膜的制备 .32.3 微孔滤膜的性质与检测 .3第三章 微孔膜过滤设备 .53.1 设备 .53.2 过滤操作与注意事项 .6第四章 微孔膜过滤的应用 .74.1 在生物化学中的应用 .74.2 在制药工业中的应用 .9第五章 结论 .10参考文献 .101第一章 前言微孔膜过滤又称精密过滤，主要用于分离亚微米级颗粒，是目前应用最广泛的一种分离分析微细颗粒和超净除菌的手段。微孔膜过滤技术因其独特的优点已逐渐取代许多经典手段而成为独立的分离和分析方法，其适应性很强。微孔滤膜孔径在 0.02514m 范围内，操作压力在 110 磅英寸 2之间。孔径为 0.010.05m 的膜可以截留噬菌体、较大病毒或大的胶体颗粒，可用于病毒分离。孔径为 0.1m 的膜用于试剂的超净、分离沉淀和胶体悬液，也可模拟生物膜。孔径为 0.2m 的膜用于高纯水的制备、制剂除菌、细菌计数、空气病毒定量测定等。孔径为 0.45m 的微孔滤膜用的最多，常用来进行水的超净化处理、汽油超净、电子工业检查、注射液的无菌检查、饮用水的细菌检查、放射免疫测定、光测介质溶液的净化以及锅炉水中 Fe(OH)3的分析等。随着微孔膜过滤技术的发展，微孔滤膜的商品种类日益增多，用来制膜的材料也叫多，如纤维素、纤维素脂、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚酰胺、丙稀腈氯乙烯聚合物及聚碳酸酯，甚至玻璃纤维等。用各种材料以不同方法制造的微孔滤膜能够适应多种分离和测定的需要。目前，用于水处理的膜材料很多，不仅有疏水性聚合物如聚乙烯、聚偏氟乙烯、聚氯乙烯等 13 。还有亲水性聚合物如聚乙烯醇、聚砜等 4,5。第二章 微孔过滤膜2.1 微孔滤膜的优点及种类1.微孔滤膜的优点是： 设备简单，只需要微孔滤膜和一般过滤装置便可进行工作。 操作简单、快速，适于同时处理多个样品。 分离效率高，重现性好。因膜孔径比超滤膜大，流速大大加快，且可在同一片微孔膜上进行分离、洗涤、干燥、测定等操作，所以不会因样品转移而2导致损失。 一些微孔滤膜具有结合生物大分子的特殊能力，根据这种选择结合作用建立的相应的结合测试分析方法，已经应用于基因工程等许多领域。2.微孔滤膜的种类（1） 再生纤维素膜 天然纤维素经化学处理后重新成形，其化学本质仍为纤维素(多糖)。该类膜能耐受热压灭菌的高温，也能经受各种有机溶剂的处理，但不能在水介质中使用。在必须处理少量含水过滤液时，为防止过度膨胀，应先将膜置于滤器中用酒精抽紧再用，可减少变形。（2） 纤维素酯膜 是目前使用最多的一类微孔滤膜，性能优良，成本较低。该类膜能耐受热压灭菌，亲水性强，孔径均匀。其中最常见的是醋酸纤维素膜，它的最大特点是不吸附蛋白质、核酸等生物分子，滤速好产品回收宰高，膜的贮藏和使用安全。硝酸纤维素膜 可耐受各种烃类、高级醇、氯化烃(除氯甲烷以外)的处理。在中等离子强度的条件下(如 0.15molL)能结合单链 DNA，此性质在基因工程操作中很有用。混合纤维素酯膜 是醋酸纤维素和硝酸纤维素的混合膜，能耐受稀酸、稀碱、醚类、醇类、烃类及非极性氯代烃等，还可过滤-200的超低温液体，但不能在冰乙酸、乙酸乙酯及丙酮介质中操作。该类膜能够结合 DNA 双链及蛋白质与 DNA 的复合物，此性质在基因工程操作中也发挥了重要的作用。（3） 聚四氟乙烯膜 化学性质极为稳定。可耐受强酸、强碱、强氧化剂、各种腐蚀性液体和各种有机溶剂，工作温度范围也大，为-180250。居于强憎水性膜。（4） 聚氯乙烯膜 物理、化学稳定性及憎水性均不及聚四氟乙烯膜，能耐受较强的酸和碱，但不耐高温，工作温度不能超过 65。消毒只能使用酒精、23甲醛、0.1硫柳汞等。（5） 超细玻璃纤维滤膜 由玻璃纤维、玻璃粉经聚丙烯酸胶黏剂黏结而成，一般厚度为 0.251.0，实为深层型滤膜。因多用于处理气体介质，有时称作“空气超净过滤纸” 。该类膜化学稳定性好，除氢氟酸及强碱外，能耐受各种化学试剂和有机溶剂，也不吸收空气中的水分，自身重量稳定性好，光学透过性亦佳，在许多有机溶剂中呈完全透明态。超细玻璃纤维滤膜的流速比一般微孔膜大，对颗粒的截留量也比微孔滤膜3大，可以阻留 98%以上比额定截留值大的颗粒。但截留分辨率不如微孔滤膜，故常与微孔滤膜配合使用，作为它的项过滤材料，以提高过滤效率并延长微孔滤膜的使用寿命。超细玻璃纤维滤膜广泛用于净化空气中，常用于制药车间、手术室、病房、精密仪表车间、电子工业及原于能、同位素实验室的空气净化处理，也用于过滤光学测定溶液中的干扰颗粒(如圆二色谱分析及拉曼光谱分析)o 在药物代谢或其它微量测定中，常用于收集细胞或沉淀，比离心法方便、可靠。超细玻璃纤维滤膜在收集同位素标记的生物高分子样品来测定软 -射线方面也表现出相当的优越性，在核酸研究领域可代替混合纤维素酯膜进行操作。2.2 微孔滤膜的制备微孔滤膜的制造方法与其它滤膜相似：先以适当的溶剂及添加剂将膜基材料制成溶胶液，然后铺成薄膜，最终移去溶剂(相转移)形成多孔的固体滤膜。因相转移的方法不同，可分为：（1） 自然蒸发凝结法 例如，纤维素能用丙酮或冰醋酸溶解，加入溶胀剂及成孔溶剂搅拌制成胶液，然后过滤去除杂质，静置或减压抽去微小气泡，在洁净的金属板、塑料板或玻璃板上铺展为薄胶层，溶剂蒸发后即成微孔滤膜。（2） 急速凝冻法 制法与超滤膜相同，即将膜基材料用溶剂溶解并加入添加剂制成溶胶液，在平面支持物上展成胶膜，溶剂少量挥发后立即投入凝固液中凝冻成膜。该法制得的微孔滤膜也是各向异性膜，上层膜面致密，孔径小，为功能层，下层为疏松的支持层。2.3 微孔滤膜的性质与检测1.孔径微孔滤膜的孔径是滤膜赖以进行选择性过滤的最重要的基础。另一个重要指征是孔径的均一程度。它是良好分离效果的保证。微孔滤膜的孔径是相当均一的，如孔径为 0.45m 的微孔滤膜，其孔径变化范围为 0.45m0.02m。因此，常作为除菌过滤、微粒检测等的保证手段，故又称为绝对过滤介质。但微孔滤膜的孔隙并不是整齐的毛细管，而是多层相连的不规则孔形的重达网状结构。因此，商品滤膜常用平均孔径、公称孔径及最大孔径等指针表示孔径规格。理论上应以最大孔径为准，但测得的最大孔径往往大于实际孔径。因此，在适当条件下，通常可以保证所有大于标定孔径值的细菌或颗粒均被截留，甚4至可截留空气中直径小于孔径 1513 的尘粒。检查膜孔径的方法较多，如气泡压力法、水流量法、液体流速法、汞压入法、电镜法、颗粒过滤法、细菌过滤法等。这些方法大多是间接测量，易受干扰，精确性也较差，但相对来说比较方便。现介绍几种常用的测定方法。（1）水流量法 这是测定滤膜平均孔径的简易方法。操作时先将滤膜以蒸馏水完全润湿，装于滤器中，下接抽气瓶。开动真空泵，使真空度稳定于70mmHg 柱，然后加入洁净蒸馏水 100ml，准确记录抽滤 100ml 水所需的时间。计算孔径： r=K 水 S GPtV式中，r滤膜孔隙半径，cm；K 水 0.265；S膜的厚度，；V蒸馏水体积，ml；G干湿膜重量差，g；P压力差，dyn 2；t过滤 100ml 水的时间，s。（2）细菌过滤法 一般选用灵杆菌(0.5m15m）检查孔径为0.45m 的膜，用绿脓杆菌（0.3m13m）检查孔径为 0.22m 的膜。操作时以无菌蒸馏水和细菌悬液配制含菌数为 1106个ml 的供试菌液，在无菌条件下分别用孔径 0.45m 及 0.22m 的滤膜过滤。滤出液加培养基于 25培养 72h，或 35培养 48h，如培养液不浑浊为合格。2.孔隙率及水萃取率微孔滤膜孔隙总体积与滤膜总体积之比为孔隙率。微孔滤膜的孔隙率一般较高，可达 80%90%，每平方厘米的孔隙数可高达 1107个。滤膜的孔隙率可由其干重和湿重进行计算：孔隙率 = 膜 体 积干 重湿 重因制造微孔滤膜时使用甘油等添加剂，故含少量可溶性成分，这些物质在使用前能够洗涤除去，可用水萃取率表示，测定时先将滤膜于 105烘 1h，称重，然后于洁净蒸馏水中煮沸片剂，换水数次，取出烘干称重，计算水萃取率。通常微孔滤膜的水萃取率。通常微孔滤膜的水萃取率小于 3%。3.厚度和重量微孔滤膜的厚度范围一般为 120150m，可用螺旋测微器加以测量。微5孔滤膜的结构疏松，孔隙率高；所以相对密度很小，按面积计仅为 5 2。4.阻力和流速微孔滤膜由于厚度小、孔隙率高和膜结构的特殊性，其过滤的阻力是很小的。滤速随孔径增大而加快，同时也受膜的结构影响。以各向同性摸为例，除阻力较大外，过滤时还易被与其孔径大小相当的颗粒阻塞，大颗粒虽不阻塞孔隙，但能在膜的表面堆积，降低滤速，增加压力也不会使大于孔径的颗粒穿过滤膜。一般来说，在一定范围内，压力增大滤速加快。微孔滤膜对液体及气体过滤速度比具有相同截留能力的滤纸要大 40 倍以上。液体流量是测定在 25，700mmHg（或 500mmHg）压力下，每平方厘米滤膜每分钟滤过的蒸馏水体积（ml）数，气体流量是测定 20时每平方厘米每分钟滤过时的空气体积（L）数。5.其它理化性质 不同类型的微孔滤膜具有不同的理化性质。大多数微孔滤膜对滤液及溶质的有效吸附量极小，生物活性物质的损失很小。纤维素滤膜介电常数为4.55，电阻率为 11010，折射率 1.5。在膜上滴加相同折光率的溴油便可在折光仪上进行测定，考察膜对物质的吸附量。微孔滤膜的使用温度多在-2080之间。除塑料膜中的聚氯乙烯膜的温度耐受性较差外，其余类型的膜多能经受热压灭菌。另外，膜的不可燃成分应低，膜的灼烧剩余物一般应在 0.5%以下。第三章 微孔膜过滤设备3.1 设备过滤设备主要由滤器及其它附件组成，其中滤器是关键设备。它是由滤膜及其它附件构成的膜组件，如注射器式滤器、玻璃滤器、平板滤器、简式滤器及多歧管式滤器等。构成滤器的材料有不锈钢、有机玻璃、塑料及聚四氟乙烯等。根据用途又可分为实验用滤器及工业用滤器。平板滤器是由输出入端、圆形垫圈、滤膜及多孔支持网等构成的。两端借螺丝固定。该类滤器用于生理盐水、葡萄糖注射液及营养剂等的除茵、除微粒，属工业用滤器，可处理 20100L 样液。其它工业滤器还有简式滤器等，用于大体积样品的超净，具有面积大、滤速快的优点。6注射器式滤器有丢弃式与可拆式之分。主要用于实验室中少量样液的除菌及除尘的超净处理，也适用于医疗单位注射用。其它的实验室滤器有多歧管式滤器。一次可处理数十个样品，适用于分析工作。3.2 过滤操作与注意事项1.滤膜的支持和滤器的密封 操作过程中应保持环境清洁，滤膜前后用特别支持体固定密封，防止高压差下短路和泄露，要避免负压时因外界空气进入引起污染。滤膜很薄，无压缩余地，应选用软垫密封。滤膜强度差，应有特别支持体，如普通钻孔板、多孔烧结板、金属细网、光刻细孔板等。应选用边缘能平整密合的滤膜。2.过滤系统严密性的检查这是保证过滤质量的关键操作，可用气泡点法（气泡-压力法）进行检查。基本原理是：要使气体将毛细管中的液体压出，必须具备克服该液体表面张力的压力。滤器出口接人一盛水容器底部，先加少量溶液低压下缓缓过滤，使滤膜充分湿润并将出口管浸没。然后用滤过的压缩空气或氮气通入滤器人口，逐渐升压，当开始有连续气泡逸出时的压力与所标气泡点接近时即属合格。也可将气体压力升至略低于气泡点，并维持 1520min，若无连续气泡逸出即属合格。3.滤膜的润湿微孔滤膜的润湿性能与使用效果有关，未完全润湿的滤膜会影响有效过滤面积及检测试验的难确性。用水可除去膜中甘油及表面活性剂，不易润湿的膜可用温水，也可将膜铺于水面，使膜中空气向上排出。对疏水性膜可先用水溶性有机溶剂(如乙醇)浸润，然后浸入水中。4.过滤速度微孔滤膜过滤纯净溶液速度轻快，但它属于筛网型滤膜，膜孔易被直径与孔径大小相近的颗粒阻塞。除过滤极少量溶液外，一般需经预滤或其它预处理通常先将样液用深层超细玻璃纤维滤膜预滤。另外，滤膜的有效面积、膜两侧压力差、孔径大小与均匀性、孔隙率、料液黏度、温度等因素对流速均有影响。在加压的方式上，正压比负压优越，除可获得较大压力差、增高滤速和设7备利用率外，还可防止空气中细菌及杂质进入滤液造成再污染。5.过滤系统的清洗和消毒为防止滤液的再污染，过滤系统必须认真情洗，凡是与滤液接触之处及设备接口处均应拆除清洗。不锈钢滤器受腐蚀的粗糙表面、螺纹、沟槽等都是富藏杂质及细菌的部位，应仔细洗刷。清洗后的过滤系统必须进行消毒。除聚氯乙烯膜外，大多数滤膜可进行热压消毒。消毒前滤器必须干燥，以防消毒时膜中水分气化而压破滤膜，再将大滤器的进出口及小滤器用牛皮纸包裹后置于高压消毒釜中；0.1MPa 压力，在121蒸汽消毒 30min。管道间的滤器可用流通蒸汽消毒。若滤膜已润湿，蒸汽压力应超过气泡点。除热压消毒外，一些醋酸纤维酯膜及再生纤维膜可于 180干热消毒 2h。对不宜加热或不便加热的滤器及滤膜可用 23甲醛水溶液或 01硫柳汞浸泡 24h，也可用环氧乙烷气体(如 90环氧乙烷加 10二氧化碳，800mgm 2)消毒 4ho6.串滤技术 又称迭滤技术。液体通过孔径自大至小相串接的滤膜的过程称为串滤。串滤装置通常是在同一滤器中重达放置数层滤膜，第一层可用超细玻璃纤维滤膳然后依次放置不同孔径的微孔滤膜，在相邻两层微孔滤膜之间各放 12 层涤纶筛网或深层超细玻璃纤维滤膜作为分布层。第四章 微孔膜过滤的应用4.1 在生物化学中的应用1.绝对过滤收集沉淀不同孔径的微孔滤膜可用于过滤收集沉淀。在收集细胞和细胞器的研究工作中，一般称绝对过滤，实际也受到许多因素影响而不可能绝对。（1）澄清溶液 在许多生物分析工作中，例如测定光吸收、荧光、光学活性(圆二色性及旋反色散)或核磁共振以及制备聚丙烯酰胺凝胶电泳样液时，都需要高度澄清的溶液。若溶液中污染了极小粒子，一股滤纸及高速离心均无法除去，可用超细玻璃纤维滤纸配合微孔膜过滤。在制备某些蛋白(如组蛋白)时，酸性拍提液静置数日或高速离心均不能澄8清，无法用丙酮沉淀，需用超离心。采用微孔膜过滤可以代替超离心法。（2）酶活力测定 生物化学研究中，常用同位素示踪法来测定催化合成生物大分子的酶的活性。即将标记底物与酶一起保温合成大分子产物，然后用沉淀剂(如沉淀蛋白质用三氯醋酸，沉淀核酸用过氯酸)将产物析出，用微孔滤膜收集沉淀并充分洗去底物，再干燥滤膜，然后直接于闪烁液中进行均相(或非均相)测定。2.结合测定在一定条件下硝酸纤维素酯滤膜及 MF(混合)纤维素酯滤膜能结合蛋白质和单链 DNA。滤膜对蛋白质的结合与离子强度无关，而结合单链 DNA 与离子强度有关。（1）蛋白质DNA 络合物的测定及纯化受体的测定 在适宜条件下，蛋白质混合物与放射性双链 DNA 能形成特殊的蛋白质DNA 络合物。络合了的 DNA也随蛋白质一起结合于膜上。这类工作以使用 Millipore 公司的产品为最理想。这种方法也用于测定被纯化的受体，因为受体能结合到放射性 DNA 的某一特定位置上。此外还可测定某些反应中的 DNA-酶中间物及某些特殊蛋白(如 RNA 聚合酶)在 DNA 分子上的结合位点。（2）mRNA 的测定及纯化 将含特定单链 DNA 的溶液通过滤膜并真空干燥。在适当条件下，将放射性 RNA 和已吸附单链 DNA 的滤膜置容器中，形成 DNARNA 杂交分子。通过吸滤及洗涤除去游离 RNA，并用胰核糖核酸酶处理(不水解结合的 RNA)除去残留 RNA，即能测出专一结合的 RNA，再加热到“熔融”温度，可释放出专一结合的 RNA，使 mRNA 得到纯化。（3）环状 DNA 的纯化 线状双螺旋 DNA 经碱处理可解旋并分开为单链。而环状 DNA 经碱处理虽变性，但两链仍缠集在一起，一旦 pH 调至中性或稍升温，则迅速恢复原状。若环状 DNA 分子两条链中一条有中断部位，则在处理过程中分离成一个线状单链和一个环状单链。此时若使它们处十中等离子强度下，用SchleicherSchuell 厂的硝酸纤维素酯滤膜过滤，则单链 DNA 分子结合于膜上，仅有环状双螺旋 DNA 分子通过滤膜并得以纯化。若需大量制备可用硝酸纤维素粉柱层析。3.其它应用（1）蛋白质含量测定 测定蛋白质含量的一般方法有双缩脲法及 Folin 法。但小肽及氨离子对双缩尿素法也呈阳性反应；芳香族氨基酸、尿酸、鸟嘌呤及黄嘌呤对 Folin 法有干扰；而还原剂巯基乙醇对两法均有影响。虽然蛋白质经9三氯醋酸沉淀再进一步洗涤，最后溶于碱液中进行测定可减少影响，但当样品很少时，无法用上法测定。此时将蛋白质用三氯醋酸沉淀(最后浓度 57)，用微孔滤膜收集沉淀，再用 510ml 三氯醋酸洗涤，最后将滤膜切成小块故人试管中，用双缩脲法或 Folin 法进行测定，可避免各种因素的影响。此外，