血清学反应

第九章 血清学反应,7/4/2018,2,一 血清学反应的概念及一般特点 抗原及相应抗体在体内或体外均能发生特异性结合，在体外结合能发生可见免疫反应。由于抗体主要存在于血清中，故称为血清学反应。 血清学反应根据抗原性质、反应条件、参与反应物质，则表现出反应有多种多样。其反应的一般特点是：,第一节 概 述,7/4/2018,3,（一）特异性和交叉性 血清学反应具有高度特异性。抗原只能与相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。 生物体的组成是复杂的，包含有多种抗原成分，在进化过程中形成不同的种类，有各不相同的特异性抗原，在亲缘种系中往往含有部分相同的抗原成分，能引起交叉反应。,7/4/2018,4,（二）结合的可逆性 抗原抗体结合是分子表面结合，这一结合受理化因素的影响，当温度超过60C或pH降至3以下时，则抗原抗体复合物又重新离群。离群后的抗原、抗体，其理化性质、免疫活性保留。,7/4/2018,5,（三）最适比与带现象 抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现可见反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物愈多。 如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之区带现象或带现象。为了避免血清学反应的带现象，需要将抗原或抗体作适当的稀释。,7/4/2018,6,7/4/2018,7,比例不适合不能完成第二步反应 带现象,7/4/2018,8,（四）反应的阶段性 抗原与抗体进行结合，可分为两个阶段： 第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，反应快，几秒钟至几分钟即完成，但无可见反应； 第二阶段为抗原与抗体的反应可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合等，反应进行较慢，需几分钟或更久。第二阶段受电解质、温度、pH值等影响。两个阶段在反应进行中无严格界限。,7/4/2018,9,（五）影响反应的因素1.电解质 血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。在凝集、沉淀反应操作时，一般用生理盐水或8%10%高渗盐水作稀释，才出现较强反应。,7/4/2018,10,2.温度 温度升高，可增加抗原与抗体分子运动而碰撞接触，加速反应的出现，故通常将抗原抗体混合后，放置37C温箱或水浴箱中，保持一定时间，促进反应。温度高，加速反应；温度低，反应时间延长，但反应结合充分，故在补体结合反应、免疫吸附实验中，采用低温放置过夜。,7/4/2018,11,3.酸碱度 血清学反应通常用pH68，过酸或过碱都可使复合物离群，pH值在等电点时，可引起非特异凝集。,7/4/2018,12,二 血清学反应的类型 沉淀、凝集、琼脂扩散、中和、补体结合和免疫吸附试验等。,7/4/2018,13,三 血清学反应的应用方式和目的 抗原抗体反应是特异性的，在应用时必须有一个是已知的，通过反应来鉴定另一个未知的。例如鉴定某一病原微生物时，多用已知抗体。诊断传染病时，对慢性病可用已知的抗原检测未知的特异性抗体；诊断急性病则用已知的抗体检测未知的抗原（病原），如炭疽病等。,7/4/2018,14,（一）抗原与抗体的快速检测 在诊断传染病、寄生虫病、变态反应、肿瘤、自身免疫疾病时，均已广泛应用血清学方法检查抗体或抗原（细菌、病毒）的存在，作为诊断疾病的手段。现已应用的间接血凝技术、对流电泳、标记抗体技术，均能快速、简便的确诊抗原或抗体。,7/4/2018,15,（二）生物活性物质的超微定量 应用酶联免疫吸附实验、放射免疫等技术，抗原抗体检测的敏感度均大为提高，已达到能精确测出Pg的水平，其敏感度已大大超过了常规的化学分析。此类技术已应用于测定动物体内的激素、维生素、药物及其他病理过程中的微量产物。,7/4/2018,16,（三）抗原或抗体在细胞与亚细胞水平的定位 用荧光抗体、酶标抗体技术，可以检测病毒或细菌在动物各种组织细胞中的分布。应用免疫酶组化法及铁蛋白标记技术进行免疫电镜观察，可以测定病毒在亚细胞水平的定位，也可测定淋巴细胞表面免疫球蛋白及抗体的产生情况。据此可分析传染病发生的机制及对免疫机理的探讨。,7/4/2018,17,（四）微生物的鉴定与分析 应用交叉凝集实验、凝集吸收实验、沉淀实验等血清学实验，进行微生物的鉴定及区别微生物的血清型，从而确定微生物的类型及其亲缘关系。还可应用琼脂扩散实验、免疫电泳等技术，对微生物的抗原组分进行分析。,7/4/2018,18,（五）血型鉴定 用细胞直接凝集实验、血凝抑制实验、溶血实验等技术，可作血型鉴定、亲子关系的确定、新生儿和出生幼畜溶血病的诊断。,7/4/2018,19,第二节 沉淀试验,可溶性抗原与相应抗体结合，在适量电解质存在下，形成肉眼可见的絮状白色沉淀，称之为沉淀试验（Precipitationreaction test）。 可溶性抗原 +免疫血清 出现沉淀现象 (血清蛋白、病毒) （抗体） 比例适合 沉淀原 沉淀素 比例不适合 不出现沉淀现象,0.85%NaCl,7/4/2018,20,一 液相沉淀试验 1环状沉淀试验 原理：试管内，下层沉淀素与上层 沉淀原在液界面应形成白色沉淀环。 用途：检测皮毛中的炭疽 杆菌抗原（Ascoli试验） 2絮状沉淀试验 抗原与抗体在试管内混合，在电解质的存在下抗原抗体复合物可形成絮状凝聚物。此法多用于毒素和抗毒素测定。,7/4/2018,21,二 琼脂扩散试验,琼脂是一种含有硫酸基的多糖，加热溶解于水，冷却后凝固成凝胶，琼脂凝胶是一种多孔结构，其孔径大小与琼脂含量有关，1%琼脂凝胶孔径为85nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。沉淀线的位置与抗原、抗体颗粒的大小、浓度，沉淀线的数目和所含抗原组分有关。琼脂扩散可分为单扩散（抗原或抗体中一种成分扩散）和双扩散。 根据其扩散的方向可分为单向单扩、单向双扩、双向单扩、双向双扩，其中双向双扩应用最广。,7/4/2018,22,1 单向单扩散,将0.6%-1%琼脂加热熔化后，加入定量经预热的稀释抗血清，混合均匀后，加入小试管中，待凝固后加入0.5ml抗原于其上，直立，置于37C中，2-3h后出现沉淀线。由于抗原的扩散，使沉淀线不断向下推移，而最初形成的沉淀带随抗原的扩散而向下推移，最后稳定。沉淀带距抗原愈近，其浓度愈大，可作抗原浓度测定。,7/4/2018,23,2 单向双扩散 基本作法同上，但在抗原与抗体之间加一层不含抗体的盐水琼脂，抗原与抗体均向中间琼脂扩散，形成沉淀带。主要用于抗原成分的分析。,7/4/2018,24,3 双向单扩散 亦称辐射扩散。在平皿或玻板上进行。用2%缓冲琼脂盐水，加热融化，待冷后加入经预热的抗血清（用1：5-10倍稀释），混合后倒入平皿或玻板上，厚2-3mm。凝固后在凝胶板上打孔，孔径2-3mm，孔内滴加抗原液，放置湿盒中37C下扩散。抗原在孔内向四周扩散，与凝胶中的抗体接触，形成白色沉淀环，白环的大小随抗原的浓度而增大。此法在兽医临床上用于蛋白质定量实验。,7/4/2018,25,4双向琼脂扩散（琼扩） 此法系采用1%琼脂倒于平皿或玻片上，制成凝胶板，可按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在37C湿箱中24-72h后观察。在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每一种抗原成分出现一条沉淀带。,7/4/2018,26,结果判断： 如两个相邻孔之间抗原相同，则沉淀带融合；抗原则不同，则互相交叉；部分相同则部分融合，另外不同部分则交叉。,7/4/2018,27,特点：简便、敏感性低、耗时、应用最广用途：常用于细菌、病毒的鉴定，抗血清效价的测定，抗原组分的分析及传染病的诊断等，如马传染性贫血病的诊断。,7/4/2018,28,第三节 凝集试验,细菌、红细胞等颗粒状态的抗原与相应的抗体结合后，在电解质存在时相互凝集成絮片状团块，这种试验称为凝集试验（Agglutiation test）。 参与反应的抗原叫凝集原；参与反应的抗体称为凝集素，主要有IgG、IgM。凝集实验有直接凝集试验和间接凝集试验两种。,7/4/2018,29,基本原理： 生理盐水颗粒性抗原 + 相应抗血清 颗粒凝集 (细菌、红细胞) 比例适合 凝集原 凝集素 多 后带现象 （稀释血清）,7/4/2018,30,一、直接凝集试验 颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。按其操作方法可分为玻片发和试管法。,7/4/2018,31,1玻片凝集试验 将已知的抗血清1-2滴，滴于清洁玻片上，取待检菌液（抗原）加于其上，混合均匀，数分钟后可出现颗粒状或絮片状凝集，谓之阳性反应。 特点：简单、快速 用途：定性，细菌鉴定、血型鉴定。如用已知的沙门氏菌血清，鉴定沙门氏杆菌的抗原组分以定型。此法也用于畜禽传染病诊断，如用已知的鸡白痢有色平板抗原，检查鸡血清中有无相应抗体，进行鸡白痢检疫,7/4/2018,32,2试管凝集试验,是一种定性与定量相结合的方法。试验时用一列试管，将待检血清用0.5%石炭酸生理盐水作10倍递进稀释，每管维持量为0.5ml，一管不加血清作对照。每管中加入一定浓度的抗原0.5ml，混合均匀，在37C或室温下静置数小时，观察液体的亮度及沉淀物，视不同的凝集程度记录为+（100%菌体凝集），+（75%凝集），+（25%凝集）。,7/4/2018,33,凡能与一定量抗原发生50%凝集（+）的血清最高稀释度，为血清的凝集价或效价（滴度）。在试验时，必须建立阴性、阳性血清对照管。 特点：准确、耗时 用途：诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价(定量),7/4/2018,34,二、间接凝集试验 基本原理： 可溶性抗原+惰性载体（聚苯乙烯乳胶微粒、炭粒、绵羊红细胞等） 抗原致敏载体 抗原致敏载体+相应免疫血清(抗体) 电解质 被动载体凝集(间接乳胶凝集、间接炭素凝集、间接红细胞凝集等 ),7/4/2018,35,特点：敏感(在微量反应板中进行试验)、快速。用途：用已知抗原致敏的载体可检测血清中的特异抗体及其效价。 若用已知免疫血清（Ab）致敏的红细胞，则可检测病毒等可溶性抗原称为反向间接血凝试验。,7/4/2018,36,7/4/2018,37,（正向）间接凝集反应原理示意图,7/4/2018,38,（反向）间接凝集反应原理示意图,7/4/2018,39,间接凝集抑制反应原理示意图A：标本中含抗原 B：标本中不含抗原,7/4/2018,40,第四节 与补体有关的试验,一、补体的性质 补体是存在于正常动物血清中的一组蛋白质。 补体没有特异性，它能与任何抗原抗体复合物相结合，但不能与游离的抗原或抗体相结合。 补体与抗原抗体的复合物结合后，可出现溶血反应、溶菌反应、补体结合反应、凝集反应、免疫黏膜试验等。由于补体具有这一特性，故常用其来检验抗原或抗体是否发生特异性结合，特异性抗原或抗体是否存在。,7/4/2018,41,二、溶解试验1.溶血试验 红细胞与相应的抗体（溶血素）相结合后，在补体的参与下，可发生溶血反应（直接溶血反应），以作补体结合反应的指示系统。 吸附抗原的红细胞与抗体结合后，在补体存在下可以引起溶血反应，这种反应称为间接溶血反应。间接溶血反应只能用新鲜红细胞，而新鲜红细胞不易保存，限制了本法的应用。,7/4/2018,42,2.溶菌试验 某些细菌（如霍乱弧菌）与抗体结合后，如有补体存在，可发生细菌溶解或被杀死，这种反应称为溶菌反应或杀菌反应。,7/4/2018,43,三补体参与的试验补体结合试验 补体结合试验是应用可溶性抗原与相应抗体结合,其抗原抗体复合物可以结合补体,但这一反应肉眼看不到,如再加入致敏红细胞,即可根据是否出现溶血反应判断反应系统中是否存在相应的抗原和抗体.,7/4/2018,44,1参与反应：抗原抗体反应系统、补体（豚鼠血清）、指示系统（绵羊红细胞、溶血素）。2反应原理：（如下图所示）。3特点：敏感性特异性高。 正式试验前要进行下列测定，操作较繁（溶血素效价、补体效价、抗原效价）。4用途：用于牛肺疫、副结核、布氏杆菌病、锥虫病、马传贫、鼻疽等的检疫。,7/4/2018,45,7/4/2018,46,中和试验（病毒、毒素中和试验）原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易 感动物、鸡或鸡胚、细胞活性。例1 NDV 911d鸡胚 2448h 鸡胚死亡NDV+抗血清 911d鸡胚 鸡胚不死亡,第四节 中和试验,7/4/2018,47,例2 口蹄疫病毒(FMDV) 47d乳鼠 乳鼠死亡 FMDV+抗血清 47d乳鼠 乳鼠不死亡 用途：1.用已知血清鉴定病毒诊断病毒病2.用已知病毒检测血清抗体诊断病毒感染，测定病毒免疫血清效价（中和价）。,7/4/2018,48,第六节 免疫标记技术,免疫标记技术即是将某一个特定的易于检测的分子或原子，联结在抗体或抗原上，利用抗体（或抗原）能与相应的抗原（或抗体）结合的特性，从而检测抗原或抗体的存在及所在部位（定位）。 免疫标记技术是近年来研究血清学反应的一项新技术。它不仅可以用于抗原抗体的定性、定量，还可用于抗原抗体的定位。由于其反应的特异性敏感性高，不但在诊断疾病时广为应用，亦可应用于生物领域其他方面。,7/4/2018,49,1.荧光标记抗体技术（免疫荧光技术） 免疫荧光技术是将荧光染料标记在抗体球蛋白分子上，制成荧光抗体。当荧光抗体与相应抗原结合时，就形成带有荧光的抗原抗体复合物，在荧光显微镜下，可观察到此复合物发出的荧光。可检测标本中某种抗原的存在或抗原所在的部位（定位）。 原理：荧光素（F）+ Ab AbF(FITC）) AbF + Ag Ag- AbF Ag- AbF 用途：用AbF检测抗原 （定性、定位） 特点：敏感，需荧光显微镜,紫外光,7/4/2018,50,方法： 直接法 F 间接法 F Ag Ag比较： 检测一种抗原 标记一种动物的免疫 就须标记特异 球蛋白AbF，就能 的一种AbF 检测多种抗原 较特异 较敏感,7/4/2018,51,2.酶标记抗体技术（酶免疫测定技术）（1） 间接法 （2）双抗体夹心法原理：用途：已知抗原、酶标 已知血清抗体、酶 抗体测血清抗体 标抗体测抗原,7/4/2018,52,3. 放射免疫测定法原理：Ag+AbR Ag-AbR 或 AgR+Ab AgR-Ab 用液相闪烁仪测R放出的射线量特点：敏感性极高，需高级闪烁仪 同位素对人有放射性危害用途：用于药物、激素、酶、肿瘤抗原等测定,7/4/2018,53,四、其他免疫标记技