AIDS实验室诊断ppt课件

艾滋病的特异性实验室检查艾滋病的特异性实验室检查及临床意义及临床意义1历史回顾 1981 卡波济肉瘤（ kaposi sarcoma）病例 1982 正式提出了 AIDS或艾滋病的概念 1983年 5月 “Science”同时发表了法国巴斯德研究所的蒙泰尼埃 (Luc Montagnier)和美国国立癌症研究所的盖洛 (Robert Gallo)的论文 。 1986年 统一命名2HIV病原学 HIV属逆转录病毒科慢病毒属，颗粒呈球形，直径 90 nm 130nm。病毒的核心呈中空锥形，由两个单链的 RNA 分子组成，中间有一个柱状核心，外面包一层球形膜，由宿主细胞膜和病毒特异性糖蛋白组成。3HIV有 9个基因控制着结构和调节的功能 3个结构基因 (gag、 env 、 pol）控制病毒结构成分蛋白质的组成； gag基因编码病毒的核心蛋白； pol基因编码病毒复制所需要的酶类（逆转录酶、整合酶和蛋白酶）； env基因所编码病毒包膜蛋白，是 HIV免疫学诊断的主要检测抗原。 6个调节基因 tat, vif, vpr, vpx (vpu), nef, rev控制病毒感染细胞、整合进宿主细胞遗传物质，以及复制新病毒的能力。调控基因编码辅助蛋白，调节病毒蛋白合成和复制。 4Human Immunodeficiency Virus (HIV)Host cellproteinLipid layerNucleocapsid(p17)Reverse transcriptaseRibonucleic protein(p24)RNA with protein surround (p7/p9)Spike of envelope glycoprotein (gp120)Trans-membranous glycoprotein(gp41)5100-150 nm 6HIV-1结构蛋白Gag基因 P17（基质蛋白）P 6（出芽时作用）P24（衣壳结构蛋白）P 9（核衣壳蛋白）Pol基因 P10（ PR）P50（ RT）P15（ RN）P32（ IN）Env基因 gp120（膜表面蛋白）gp41（穿膜蛋白）Pr 66Pr 55Pr 1607HIV-1结构基因Gag基因 P 16P 26Pol基因 P 68P 53P 54Env基因 gp 105gp 36Pr 68Pr 55Pr 1408HIV-1调节蛋白基因 HIV-1 功能Tat P16/p14 增强病毒复制 1000倍Rev P19 与表达结构蛋白核新一代病毒颗粒有关Vpu P16 增强病毒颗粒释放Vif P23 促进病毒成熟Vpr P10-15 病毒产率有关 (?)Nef P25 病毒颗粒传染性 (?)9两型 HIV毒株比较HIV-1 HIV-2分布 全球性 地区性传播模式 相同 相同造成 OI 一样 一样导致 AIDS 一样 一样传染性 + +母婴传播 + +发展 AIDS 短 较长引起临床症状 + +感染模式 多 少，与 HIV-1同时感染两者交叉 40-60%HAART 佳 稍差， NNRTI差10诊断原则 艾滋病是由人类免疫缺陷病毒（ HIV）感染引起，以严重免疫缺陷为主要临床特征的传染病，其感染各期的确诊必须根据流行病学接触史、临床表现和实验室检查结果综合分析，慎重诊断。 无论处于哪一期的 HIV感染，必须要有抗 HIV抗体阳性或 HIV抗原阳性的实验室检测依据。HIV实验室检测方法包括：病毒分离培养、抗体检测、抗原检测、病毒核酸检测、病毒载量检测。11艾滋病的特异性实验室检查 HIV感染的检测对病毒及其成分的检测病毒感染后机体特异性和反应物（抗体、 特异性免疫细胞等）的测定，感染者及感染病毒状态的检查病毒水平生物学特性及作用机体免疫系统状况12HIV感染的检测目前作为诊断手段使用的检测主要包括 抗 HIV病毒抗体检测 病毒培养 核酸检测 抗原检测13血清学检测 14 HIV感染的自然史CD4细胞(cell/mm3）800400急性感染期 无症状期 艾滋病前期和艾滋病期 CD4 病毒载量抗 HIV 的 CTLHIV抗体15 在感染 HIV-1后，患者血清中最先出现 p24抗原，继之，各种 HIV-1抗原可达到高峰； 2-6周后，随着 HIV-l抗体产生及浓度的不断增加， HIV-l抗原渐趋降低或检测不出。16HIV抗体检测HIV感染后必须要以实验室检查为基础。我国现阶段 HIV实验室检测主要为 HIV抗体检测。 HIV抗体检测需要经过初筛和确认试验。 初筛试验可选择酶联免疫吸附试验（ ELISA）、明胶颗粒凝集试验（ PA）、免疫荧光法（ IF）、免疫酶法（ IE）、乳胶凝集试验（ LA）等。初筛试验结果阳性后，再做确认试验。 常用的确认试验为蛋白印迹法（ WB）。确认试验阳性时才能确定为 HIV感染17HIV抗体初筛实验 初筛检测通常由取得资格的 HIV-1抗体初筛实验室和或确认实验室中进行， HIV-1抗体确认和 HIV-1抗体阳性报告必须由取得资格的确认实验室进行。 初筛试验初筛试验用于检测 HIV特异性抗体总量。使用的抗原分细胞内 HIV抗原及细胞外HIV抗原。18血清 HIV-1抗体检测 检测 HIV抗体是常规使用的 HIV病原学诊断方法。临床通用的是酶联免疫吸附试验（ ELISA）、免疫印迹法（ WesternBlot）和目前开始推广的快速诊断法。 感染 HIV-1后，机体针对 HIV-1基因编码的抗原性物质产生相应抗体，在临床上具有重要诊断学意义的主要是对抗结构基因编码抗原 (如 gpl60， gpl20， gp41， p66， p55， p51， p31， p24， p17等 )的抗体。 19HIV抗体初筛检测 HIV 酶联免疫吸附实验（ enzyme linked immunosorbent assay， ELISA） 明胶颗粒凝集实验（ gelatine particle agglutination assay， PA） 乳胶凝集实验（ latex agglutination assay， LA） 各种快速检测实验（ rapid tests）放射免疫实验（ radio immunoassay） 20方法和原理 酶联免疫吸附试验 (Ezyme linked immunosorbentassay， ELISA)简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术，其基本方法分三类： 间接法 、 双抗原夹心法 和抗体竞争法。21实验使用的抗原 第一代试剂：完整病毒的裂解主物 假阳性反应、制备和纯化比较困难、危险性大。 第二代试剂：重组或合成多肽 HIV抗原 敏感性和特异性均有所提高，更为安全、容易、重复性好。有时由于含有载体的组分而出现假阳性结果，由于缺乏合适的立体构象有可能使敏感性下降从而导致假阳性。 第三代试剂：使用重组或合成多肽抗原 这种试剂可以检测针对 HIV抗原的所有抗体亚型，不需要将标本过度稀释来保证特异性，因而具有较高的敏感性。22 初筛检测的阳性结果不是最终结论，样本经复检仍为阳性，应及时送实验室进行确认； 初筛检测的宗旨是避免漏检 敏感性高，必须为 HIV-1/2混合型； 交叉反应性或假阳性反应：如系统性红斑狼疮和风湿病者体内的自身抗体与 HIV-1的某些抗原决定簇有交叉反应性 还应注意假阳性，以及实验操作过程中的技术误差； 不同厂家及同一厂家生产的不同批次试剂的敏感性和特异性可能存在一定差异，各实验室最好应用标准质控血清对新购试剂及在每次检测时进行质量控制和质量评价。23快速试剂 人类免疫缺陷病毒（ HIV） 1+2型抗体诊断试剂（胶体硒法） lnstant CHEKTM-HIV 1+2是金标快速诊断试剂 24PA 定量试验C 对照颗粒S 致敏颗粒M 阴性颗粒25HIV抗体确认实验 待血清初筛试验结果为阳性时，需再经确证试验检测，后者阳性时才能确定为 HIV感染。 根据卫生部规定， HIV-1抗体阳性报告必须由卫生部认证并取得资格的 HIV抗体确认实验室出具才有法律效应。 最常用的 HIV-1抗体确认实验方法是免疫印迹法（ Wwstern Blot,WB）和条带免疫印迹法（Strip Immunoblot Assay, SIA或 Linear Immunoblot Assay, LIA） ,其中以 WB法最常用。 26HIV-1抗体免疫印迹实验 免疫印迹实验 （ westen blot,WB）是广泛用于许多传染病诊断的实验方法 就 HIV的病原学诊断而言，它是首选的用以确认 HIV抗体的确认实验方法， 用于检测单克隆或多克隆抗体识别的抗原， WB的检测结果常常被作为鉴别其他检验方法优劣的 “金标准 ”。 能同时检测不同 HIV-1抗原组分的抗体，因此能够鉴别或肯定初筛检测的结果。 27条带免疫印迹法 工作原理和操作方法与 WB实验基本相同，只是条膜上抗原来源和组成有所区别。检测时信噪比高，本地清晰，无潜在假阳性干扰，且可通过调整条膜上 HIV抗原量，克服了 WB实验中使用病毒裂解产物而可能产生的固相载体上某些重要抗原量不足的缺点。这类试剂特异性很高，但也可能由于病毒株在所合成抗原决定簇部位发生突变导致 HIV抗体假阴性结果；另一个缺点是由于合成抗原不能糖基化，其立体构像与天然抗原分子有一定差异，在一定程度上可能影响了模拟真实 HIV抗原检测抗体的能力。 28HIV抗体 WB实验的阳性判断标准美国 CDC GP41或 GP120/GP160或 P24中的两条带美国 FDA P24和 P31，以及 GP41或 GP120/GP160之中任意一条世界卫生组织 两条 ENV带，也可能存在 Gag或 Pol带泛美卫生组织 P24或 P31中的一条，并有一条 ENV带美国红十字会