免疫组化技术

组织化学技术 江苏大学江苏大学 基础医学与医学技术学院基础医学与医学技术学院卢小东卢小东组织化学的基本概念：组织化学的基本概念：组织化学： 组织水平，对组织内存在的各种组织水平，对组织内存在的各种物质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位物质进行定性、定量以及其局部的和移动的部位分析的方法分析的方法 免疫组织化学：免疫组织化学： 基于抗原抗体反应基于抗原抗体反应 酶组织化学酶组织化学疾病的病理学研究概括起来主要在疾病的病理学研究概括起来主要在 基因基因 和和 蛋白蛋白水平上进行的研究。水平上进行的研究。免疫组织化学免疫组织化学 方法主要用于基因方法主要用于基因 蛋白质蛋白质 水平水平表达的研究。表达的研究。蛋白表达蛋白表达 =分布，定位，定量；分布，定位，定量；蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等蛋白表达与与肿瘤生物学行为及预后关系等材料：材料：抗体：抗体：多克隆抗体多克隆抗体 ：为针对多个抗原决定簇的抗：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。单克隆抗体单克隆抗体 ：为一个：为一个 B淋巴细胞分化增殖产淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。性强。显示物：显示物：酶标反应：酶标反应： 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 （ Alkatine phasphotase,AP）AP与不同的底物（萘酚与不同的底物（萘酚 As-Mx、快蓝、快红）作、快蓝、快红）作用，可形成不同颜色的终产物。用新品红（用，可形成不同颜色的终产物。用新品红（ New fuchsine）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉）显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。淀，不褪色。 辣根过氧化酶辣根过氧化酶 (Horseradise peroaidase,)HRP： 底物为底物为 DAB 四盐酸二氨基联苯胺，产生棕四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。色沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。 HRPAPHE荧光标记：荧光素标记抗体荧光标记：荧光素标记抗体异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（ Fluorescien isothioyarale, FITC） 520 530nm四甲基异硫氰酸罗达明（四甲基异硫氰酸罗达明（ Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm四乙基罗达明（四乙基罗达明（ Teraethyle rhodamine B200, RB200） 590 600nm胶体金：胶体金：指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中，免疫电镜观察免疫电镜观察 主要方法：主要方法：直接法：直接法：间接法：间接法： 经过了第二抗体放大效应经过了第二抗体放大效应PAP法：法： 以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体形成复合物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以物，通过第二抗体的桥接与第一抗体结合，然后以酶底物反应检出。酶底物反应检出。 ABC法：法：生物素生物素 （ Biotin） 和和 卵白素卵白素 （ Avidin） 为具有高为具有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合 4个生物个生物素。当生物素标上特定的标记物质后素。当生物素标上特定的标记物质后 or与抗体结与抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的生物素的结合反应，而以适当方式显示。的结合反应，而以适当方式显示。S-P法（法（ LSAB）：）：采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测定细胞和组织中的抗原。定细胞和组织中的抗原。 Envision 法（二步法）：法（二步法）：原理：第二抗体上标记有多聚物酶（原理：第二抗体上标记有多聚物酶（ HRP or AP） 复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可结合许多的结合许多的 HRP分子，使信号有显著提高，敏感性分子，使信号有显著提高，敏感性较较 PAP法，法， ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡聚法高出几十倍，背景因多聚物葡聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方法更省时，简便。更省时，简便。 以以 LSAB法为例简单介绍染色步骤：法为例简单介绍染色步骤： 石蜡切片脱蜡水；石蜡切片脱蜡水； 3%H202抑制内源性过氧化物酶抑制内源性过氧化物酶 15min； 每张切片加每张切片加 10-20ul非免疫性动物血清，室温孵育非免疫性动物血清，室温孵育5min； 加特异性一抗，加特异性一抗， 370C孵育孵育 30 60min， or 40C过夜；过夜； 加加 20ul生物素标记的第二抗体，生物素标记的第二抗体， 370C ， 30min； 加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素， 370C，30min； 以上每步后均用 PBS液洗 33min ； 用 过氧化物酶基质液（ DAB基质液）显色 5 15min。 在光镜下观察。 自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝， 梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。免疫组化常见问题的处理：免疫组化常见问题的处理：组织材料的处理：组织材料的处理：固定液为：固定液为： 10%中性福尔马林液；中性福尔马林液；4%多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛磷酸缓冲液（ PH7.4）；）；固定时间：固定时间： 8-24hr组织大小：组织大小： 2*1.5*0.3cm 防脱片处理：防脱片处理：多聚 -L-赖氨酸；硫酸铬钾明胶液。增强特异性染色的措施和方法：增强特异性染色的措施和方法：1）蛋白酶消化：）蛋白酶消化： a、胰蛋白酶消化、胰蛋白酶消化（ 0.05-0.1%）；）；b、胃蛋白酶消化（、胃蛋白酶消化（ 0.4%）。）。2）热诱导的抗原修复：）热诱导的抗原修复：方法：微波方法：微波 960C, 10min；直接加温方法直接加温方法 1000C, 10min；高压锅高压锅 1200C, 10min；热处理液：热处理液： 0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 合适的抗体稀释度：合适的抗体稀释度：过高，过低均会导致阴性结果。即用型抗体；浓缩型。减少或消除非特异性染色的方法：减少或消除非特异性染色的方法：非特异性染色：原因：方法：对照：阳性对照： 用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。阴性对照： 用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。 染色染色 特异性染色特异性染色 非特异性染色非特异性染色显色部位显色部位 特定细胞或间质特定细胞或间质 细胞和间质均匀染色或更强细胞和间质均匀染色或更强显色定位显色定位 特定，具有结构性特定，具有结构性 无特定部位，无结构性无特定部位，无结构性显色程度显色程度 同一部位呈不同程度显同一部位呈不同程度显色色无分布规律，某一片均匀着无分布规律，某一片均匀着色色免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。以此作为定性、定量和定位的依据。阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可显著区别。是累及一片细胞，两者可显著区别。阳性细胞的染色特征：阳性细胞的染色特征： 阳性细胞的染色分布有三种：阳性细胞的染色分布有三种：胞浆；细胞核；细胞膜表面胞浆；细胞核；细胞膜表面 阳性细胞分布：阳性细胞分布： 灶性；弥漫性灶性；弥漫性 染色强度不一染色强度不一 切片边缘，刀痕切片边缘，刀痕 or组织折叠，坏死，挤压区组织折叠，坏死，挤压区，胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。，胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。对于阳性结果的定量判断：对于阳性结果的定量判断：-， +， +， +等分级和计数统计等分级和计数统计垂体腺瘤 ACTH乳腺癌 c-erbB-2免疫组化A细胞 B细胞D细胞上皮性肿瘤标记上皮性肿瘤标