分子生物学实验技术

分子生物学实验技术一、基因克隆技术n 目的基因和载体n 限制性内切酶酶切n DNA连接酶连接n 转化n 抗性筛选获得基因序列：通过 RT-PCR或基因组数据库获得引物设计及 PCR扩增目的片段PCR产物连接到载体上构建成重组载体重组载体转化到大肠杆菌中进行质粒扩增或表达蛋白抗性筛选基因克隆实验的一般过程质粒转化大肠杆菌的过程 感受态非定向克隆+或克隆的片段只能按特定方向 连接定向克隆+EcoR I+Hind III切EcoR I Hind III EcoR I Hind IIIEcoR I Hind IIIEcoR I Hind IIIA AEcoR I+Hind III切PCR扩增EcoR IHind III（二）基因组 DNA文库构建某个生物的基因组 DNA或 cDNA片段与适当的载体在体外重组 后， 转化宿主细胞 ，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的 阳性菌落 （或噬菌体），所有菌落或噬菌体的 集合 即为该生物的基因文库。外源 DNA片断、载体、宿主构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因基因组 DNA文库的构建基因组 DNA文库的类型质粒文库 （ 10kb)噬菌体文库 （ 0-23kb)黏粒文库 ( 45kb )酵母人工染色体文库 (又称大片段基因组 DNA文库，100kb1Mb ）基因组 DNA文库的构建流程插cDNA文库的构建基因组 DNA文库与 cDNA文库的 比较（三） PCR衍生技术PCR过程 反转录 PCR实时荧光定量 PCRn PCR反应体系中加入 荧光基团 ，利用荧光信号累积实现 实时监测 整个 PCR进程，对 起始模板 进行定量分析的方法。n 荧 光 阈值 是在 荧 光 扩 增曲 线 上人 为设 定的一个 值 ，它可以 设 定在 荧 光信号指数 扩 增 阶 段任意位置上，一般 荧 光域值 的 设 置是基 线 （背景） 荧 光信号的 标 准偏差的 10 倍。n 每个反 应 管内的 荧 光信号到达 设 定的域 值时 所 经历 的 循环 数 被称 为 CT 值 （ threshold value ）。 荧光定量 PCR化学原理非特异性荧光标记：1、 SYBR Green 特异性荧光标记：2、 TaqMan1、 SYBR Green 法SYBR Green 熔解曲线分析2、 TaqMan探针法TaqMan作用机理原位 PCR技术原理由于细胞膜和核膜均具有一定的 通透性 ，当进 PCR扩增时，各种成分（如如引物、 DNA聚合酶、核苷酸等）均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的 RNA或DNA为模板，与原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大、或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定 DNA或RNA序列在原位以呈指数级扩增，扩增的产物就可以被原位杂交技术检测出来。重叠延伸 PCR技术由于使用了具有 互补末端 的引物，使PCR 产物形成了 重叠链 ，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段 重叠拼接 起来。可简单迅速的将两个 DNA片段连在一起，用于 嵌合基因 的构建重叠延伸 PCR原理二、基因组学研究n 标记性示踪物 放射性和非放射性n 基因活性和功能研究：基因表达系列分析，DNA微阵列和微芯片，体内带白纸积累的检测，基因敲除， RNA干涉三、 DNA-蛋白互作技术n 过滤结合n 染色质免疫沉淀法n 凝胶阻滞分析n DNA酶足迹n DNase足迹法， DMS足迹法酵母单杂交n 将已知顺式作用元件构建到最基本启动的上游，把报告基因连接到启动子下游，将编码待测转录因子 cDNA与已知酵母转录 激活结构域（ AD） 融合表达载体导入酵母细胞 ，该基因产物如果能与顺式作用元件结合，就能激活启动子使 报告基因 得到表达。酵母双杂交n 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（ BD)和转录激活域（ AD)n 单独的 BD与特定基因的启动区结合，但不能激活基因的转录，而由不同转录因子的 BD和 AD所形成的杂合蛋白却能形式激活转录的功能。凝胶阻滞n 在凝胶电泳中，如果 DNA与某种蛋白质相结合，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在电泳中移动的距离变小，表现为相对滞后。DNaseI足迹n 蛋白质与 DNA特定区段相结合，从而使该区段DNA免受 DNase的降解，在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记条带。染色质免疫共沉淀（ ChiP）n 在活细胞状态下固定 蛋白质 -D