动物分子遗传育种学第4章

概念： 转基因动物 是指通过 DNA操作过程将外源基因 整合 在染色体基因组内并能 遗传 给后代的一类动物。第三章转基因动物育种（自 1982以来）已成功：小鼠、大鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛、鸡、鱼等多种转基因动物。第一节动物转基因技术的理论基础染色体交换与基因转移：联会转座子基因组内转基因（自然产生）生物界的这些现象及其发现是转基因动物得以产生的一个基础。物种进化与基因表达调空：物种进化产生多种物种重要基因高的保守性表达调空机制相似或相同被 转基因成功表达生物界的这些现象及其发现是转基因动物得以产生的又一基础。基因组研究与分子克隆：基因组计划 遗传图物理图转录图序列图DNA重组及克隆转基因动物这些技术的产生和发展是转基因动物得以产生的主要基础。转基因的表达特征：（ 1） 时空 特异性表达（ 2）可控性表达（ 3）共抑制性 （ 当转基因和内源基因存在同源关系时，二者的表达均受到抑制，其原因极其复杂，目前尚未完全清楚 ）（ 4）沉默现象原因： a.整和在不适当的部位。b.被受体细胞识别为异己 DNA后将其甲基化而失活。c.转基因本身构建不恰当，而无法转录表达。转基因动物的成功率受精卵（开始） 转基因动物子代（结束）总成功率：阳性动物子代数 待转基因受精卵数物种 受胎率 % 产仔率 % 整和率 % 总成功率 %牛 20 10 5-10 0.5羊 40 15 5-10 1猪 40 5 10-15 0.5图 50 10 10 1大鼠 60 10-20 15 2小鼠 80 - 24 4不同动物的转基因成功率动物转基因的技术：（ 1）上游技术： 是指利用分子遗传学和分子生物学技术进行基因改造，载体构建，最后组装成转基因单位的一系列方法技术。（ 2）中游技术：包括外源基因导入受体细胞、胚胎移植、转基因动物的繁育建系等。 （ 3）下游技术：是指转基因的整和表达情况的检测。下游技术的检测方法：（ 1）在染色体和DNA水平上：a. Southern 杂交b. PCR扩增c. 荧光原位杂交（ 2）在 mRNA水平上：a.Nouthern blot杂交b.RT-PCR扩增（ 3）在 Pr水平上：Western blot杂交。（ 4）表型水平上： 检测转基因动物在生长速度、抗病性、产品质量等方面与原来动物有无差异。第二节转基因动物的研究方法转基因动物的常用方法：（ 1）显微注射法（ 2）逆转录病毒法（ 3）胚胎干细胞法（ 4）精子载体法显微注射法：外源基因构建 准备受精卵 显微注射胚胎移植转基因检测优点： （ 1）安全（无病毒基因组序列）（ 2）转移率高（整合率达 30%）（ 3）相对较短周期内可得到纯合体缺点： （ 1）设备昂贵，所需技术性很强。（ 2）转基因的拷贝数无法控制，通常为多拷贝，最多可达几百个（ 3）通常在插入点引起突变（重组、缺失）造成动物生理缺陷显微注射法：逆转录病毒法：逆转录病毒：是一种整合性的单链 RNA病毒。该方法就是将外源基因重新组合在逆转录病毒载上，然后在去感染着床前或着床后的胚胎，将外源基因导入动物细胞内，是目前开展动物转基因研究中最有效的方法一。优点 :（ 1） 整合率高。（ 2）单位点、单拷贝。（ 3）插入位点的克隆分析较容易。缺点 :（ 1） 逆转录病毒容量小，转移片段一般小于 10kb， 故被转入基因通常无调空序列。 （ 2）病毒基因组有可能与外源基因一起整合到受体细胞染色体上，造成转基因动物的污染，限制了其在商业转基因动物中的应用。逆转录病毒法：胚胎干细胞法通过 显微注射法 或 逆转录病毒法 将外源基因引入到ES细胞内，使外源基因整合到 ES基因组内某一非必需基因位点上 ,再对 ES细胞进行筛选鉴定和培养扩增 , 用于生产转基因动物 .优点 :(1)外源基因整合与表达可以在干细 胞中检 测 .(2)可以对 外源基因进行定点整合 .缺点 : 需要经过多代的选育 ,才能得到纯合的转基因动物 ,这对牛、羊等产仔数少，世代间隔长的大动物来讲是很困难的。胚胎干细胞法精子载体法利用精子作为转移外源基因的载体，通过受精将外源基因带入卵细胞，并整合在染色体上的一种方法。实际上很早以前，人们就已发现， 通过受精过程，精子可以将外源基因带入卵细胞。但到目前为止，人们尚不清楚这种过程的确切机制。不过这并不影响精子载体法在转基因动物研究中的应用。精子与外源基因结合的部位：（ 1）精子的整个头部区域。（ 2）精子的头前区域。（ 3）精子的头后区域。该种结合一般不出现在精子的尾部。影响精子与外源基因结合的因素：（ 1）外源基因的大小（大优于小）。（ 2）精子头部的特异性蛋白质（有促进）（ 3）清洗精子（有促进）外源基因的存在方式：（ 1）整合到受体细胞的染色体上。（ 2）外源基因以附加体的形式存在（易丢失，但通过设计增加自主复制序列可以稳定存在，并正确表达而得到转基因动物）。优点：（ 1） 方法简单实用，只通过人工受精就可生产转基因动物。（ 2）以附加体形式得到的转基因动