南京农大动物生物化学课件17

第第 17章章 核酸技术核酸技术Technology of Nucleic Acid本章主要内容：4 DNA重组技术4 基因鉴定4 核酸技术的应用 对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组 DNA技术使人类千百年的梦想变为了现实。一个梦想已成真生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了 “硕鼠 ”1.DNA重组技术DNA重组技术 是利用多种限制性内切酶和 DNA连接酶等工具酶，以 DNA为操作对象，在细胞外将一种外源 DNA（来自原核或真核生物）和载体DNA重新组合连接（重组），形成重组 DNA，然后将重组 DNA转入宿主细胞（如大肠杆菌等），使外源基因 DNA在宿主细胞中随宿主细胞的繁殖而增殖，并在宿主细胞中得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。 “ 基因工程 ” （ gene engineering）或 “ 分子克隆 ” （molecular cloning）。 基因重组技术的两个基本目的1.直接利用基因主导生长的基因、作物的抗性基因、基因诊断、基因治疗、指纹图谱等2.利用基因的表达产物疫苗、药物、组织激活物、生长因子、珍稀蛋白等50年来，核酸酶学的进步为 DNA的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的核酸酶有：DNA聚合酶（ DNA polymerase ）klenow 片段， Taq 酶限制性核酸内切酶 （ restriction endonuclease ）逆转录酶（ Reverse transcriptase）S1核酸酶（ S1 nuclease）连接酶（ Ligase）拓扑异构酶（ Topoisomerase） 等核酸酶学限制性核酸内切酶 一把神奇的 “ 手术刀 ”具有内切和甲基化两种功能能够识别外源的核酸并将它切除有特异的识别位点，通常为 4-8对碱基的旋转对称结构在其切口处留下黏性末端（ sticky end） 具有互补序列的单股链，或者平头末端（ blunt end）有 3种类型， II型为主例如：EcoRI属种 品系排序限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下 黏性末端 ）目的基因克隆的技术路线获得目的基因选择合适的可以携带目的基因的载体把目的基因插入到载体中去，得到重组载体将重组载体导入宿主细胞进行克隆 （ 通过无性繁殖，随着宿主目的基因也得以扩增 ）对重组的克隆进行筛选使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因黏性末端（如质粒，噬菌体等）（如细菌）目的基因克隆的技术路线利用表型特性，核酸杂交以及免疫化学等方法对克隆进行筛选目的基因的制备F 直接从染色体中分离F 人工合成F 逆转录合成 cDNAcDNA文库：用细胞全部 mRNA经反转录制备全套 cDNA后建库。F 构 建 基因文库F PCR扩增 质粒是可以独立复制并在细菌之间转移的遗传单位，质粒还能赋予宿主菌某种表型其他的基因载体还有如：噬菌体，病毒等目的基因的载体plasmid DNAGenomic DNA含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）古埃及一具木乃伊的一个DNA 片段已经得到克隆打开了人们窥探过去的窗户2.基因鉴定聚合酶连锁反应 （ PCR, DNA polymerase chain reaction ）目的基因可以通过以下系统在试管中得以大规模扩增一个温度和时间可以控制的反应体系 含有双链 DNA模板耐热的 DNA聚合酶（如 Taq酶）一对设计适当的 RNA引物， dNTP原料，过量经 “ 变性 -退火 -延伸 ” 多次循环使目的 DNA得以扩增DNA核苷酸序列分析 Sanger双脱氧链终止法利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股DNA或 RNA片段 探针 （ probe），可以： 研究 DNA之间的亲缘关系； 发现基因的缺失或突变； 测定某种遗传信息的量； 鉴定某种基因 基因治疗等分子杂交 （ Molecular hybridization）分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础印迹技术（ Blotting）Southern blot 用探针鉴定 DNANorthern blot 用探针鉴定 RNA原位杂交（ Hybridization in situ）指纹分析（ Finger printing）基因芯片（ DNA microarray）分子杂交等技术可用来筛选重组克隆用探针鉴定 DNA称为 Southern印迹 ,鉴定 RNA称为 Northern印迹Southern-blot印迹杂交原理示意图 染色体的原位杂交基因芯片的应于发育生物学研究在基础研究和应用领域具有广泛用途的 DNA 芯片同一物种不同生态型之间 DNA多态性产生的 RFLP DNA指纹 （ DNA fingerprint） DNA指纹分析应用于刑侦1. 5. 9. Marker， 8. 10 都是对照2. 嫌疑人 A血细胞 DNA3. 被害人衣服上残留精液 DNA4. 嫌疑人 B血细胞 DNA6. 被害人阴道取样 DNA7. 被害人血 DNA8. 实验对照从上世纪 90年代初开始，用了 10年时间，人类完成了对自身染色体的 30亿对碱基的序列测定，这就是所谓的 人类基因组项目（ HGP）在人类基因组项目基本完成之后， 人类蛋白质组项目 将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋白