天然高分子材料之胶原

组织工程学天然高分子材料胶原骨组织的等级结构Hierarchical architechture of bone骨的等级结构（ 1）密质骨和松质骨；（ 2）密质骨骨单位和哈氏管，（3）骨层板和（ 4）胶原纤维 组成的胶原纤维束胶原纤维结构组成 胶原分子中间部分的氨基酸排列。 （ a）每个第三个氨基酸残基是甘氨酸， X 和 Y通常是脯氨酸和羟脯氨酸残基，（ b）甘氨酸是最小的氨基酸，（ c）三股螺旋使得甘氨酸残基指轴内，而另外两个残基处于螺旋表面，（ d）脯氨酸和羟脯氨酸的残基与多肽链结合，增强分子的刚性。疏松结缔组织成纤维细胞、 巨噬细胞 浆细胞、 肥大细胞 细胞：脂肪细胞 未分化的间充质细胞白细胞p 组成： 胶原纤维纤维： 弹性纤维网状纤维蛋白多糖基质： 纤维粘连蛋白组织液Typical Extracellular matrix细胞外基质（ extracellular matrix, ECM）p ECM是细胞外大分子构成的网络。包括：胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、弹性蛋白等。p 结缔组织中含量较高。p 影响细胞的存活、死亡、增殖和分化。Collagen 胶原p 胶原是动物中的主要纤维蛋白，是所有多细胞动物，包括海绵体、无脊椎动物和脊椎动物的细胞外基质的主要结构成分。p 胶原原纤维占人和高等动物总蛋白量可高达 30%，其作用是保持组织完整以及提供每一个结缔组织所需要的特殊力学性能。p 人体中有 16左右是蛋白质，胶原占体内蛋白质总量的30 40，主要存在于皮肤、肌肉、骨骼、牙齿内脏和眼睛瞪部位。p 从生物医学角度，胶原在发育、伤口愈合、血小板活化和血管生成中具有重要作用。另外很多遗传病的起因也被证明是由于胶原发生了突变，而胶原在其合成、降解或免疫学方面的微小变化也可以引起许多疾病。胶原的结构p 胶原是一类由 20种常见的氨基酸合成而来的蛋白质，但是它在氨基酸组成、重复的序列模式、高度的翻译后修饰和特有的分子内交联上别具一格。p 天然的胶原蛋白是一个由 3条具有左手条具有左手 螺旋的链相互缠绕形成 右手超螺旋右手超螺旋 的分子。胶原的超螺旋结构是靠链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持其稳定性的。p 原胶原： 3条肽链形成的螺旋，含三种结构：螺旋区、非螺旋区及球形结构域。Structural features p All collagen molecules are trimers consisting of three polypeptide chains, called chains. p Along at least part of their length, the three polypeptide chains of a collagen molecule are wound around each other to form a unique, rod-like triple helix.p 一个典型的胶原分子长 300nm、直径为 2.5nm。在每一条左手螺旋的胶原链内，每一圈螺旋需要 3个氨基酸残基。胶原螺旋的螺旋度不象 -螺旋那么高。胶原螺旋的左手性，以及胶原的许多刚性源于许多脯氨酸残基的立体限制。胶原分子的末端含有非螺旋部分，这一部分似乎对纤维形成过程中胶原分子的正确排列以及交联是必需的 。p 典型的胶原螺旋在任一圈的第 3个位置上都含有 甘氨酸 残基。胶原的特点是具有重复的 -Gly-X-Y-序列，其中 X常常是 脯氨酸 ，而 Y是 4-羟脯氨酸 ，它是脯氨酸的共价修饰衍生物。脯氨酸和 4-羟脯氨酸的总和占胶原分子中残基数的四分之一。除了 4-羟脯氨酸外， 5-羟赖氨酸也常出现在胶原分子中。p 一条链上的每一组 -Gly-X-Y-中的甘氨酸残基的酰胺氢原子都能与一个相邻链上的残基 X的羰基氧原子之间形成分子内氢键。脯氨酸和羟脯氨酸残基在胶原的结构中起着至关重要的作用，这些残基的有限的构象松弛度不仅可以防止 -螺旋的形成，而且可以使得胶原螺旋和胶原纤维本身显示出点刚性。羟脯氨酸残基的羟基参与形成的氢键将使胶原三股螺旋更稳定。胶原分子中间部分的氨基酸排列。 （ a）每个第三个氨基酸残基是甘氨酸， X 和 Y通常是脯氨酸和羟脯氨酸残基，（ b）甘氨酸是最小的氨基酸，（ c）三股螺旋使得甘氨酸残基指轴内，而另外两个残基处于螺旋表面，（ d）脯氨酸和羟脯氨酸的残基与多肽链结合，增强分子的刚性。-N-C-CO-H HH-N-C-CO-H2C CH2CH2H-N-C-CO-H2C CH2CHHOH甘氨酸 Gly-脯氨酸 Pro-羟脯氨酸 Hyp-原胶原分子二级结构 原胶原形成胶原纤维 胶原纤维电镜图胶原类型p 在原纤维中发现了 20种胶原，其中 5种含量最丰富的胶原类型是：nI 型胶原是骨、腱、角膜和韧带中的主要胶原，最高可达体内所有胶原的 90%。nII 型胶原在软骨、玻璃体和脊索中形成原纤维。nIII 型胶原与 I 型胶原并存于结缔组织。nV型和 VI型为异三聚体，与其他三种胶原共存于原纤维中。 p 由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、上皮细胞分泌。在RER上合成，形成三螺旋之前于 Pro及 Lys残基上进行羟基化修饰。p 羟化反应由脯氨酰 4羟化酶（ P4H）、脯氨酰 3羟化酶催化（ P3H）。p Vc是酶的辅助因子， Vc缺乏导致坏血病。p 交联：由侧向相邻的 lys或 hyl残基氧化后所产生的两个醛基间进行缩合而成。交联后后形成不溶性纤维，原胶原呈阶梯状排列，电镜下可见间隔 67nm的横纹胶原的体内合成（翻译）Collagen fibril bundles: a branching assembly unit in tendon morphogenesisTEM image of collagen胶原的一般生化特性 变性p 胶原变性是指三股螺旋之间的氢键断裂，螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质的改变（比如粘度下降、沉降速度增加、浮力上升、紫外吸收增加等）。加热、改变胶原溶液的 pH值或受有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等影响，均可使胶原变性。p 通常把 50%胶原分子发生变形的温度称为变性温度 Td（ denaturation temperature）。由于这一现象和结晶的熔解相类似，故又称为熔点或熔解温度。胶原的变性温度与羟脯氨酸的含量呈正相关。其它生化特性p 天然胶原除非先经尿素处理使之变性，否则不易溶于碱、弱酸及一般浓的中性盐类。p 等电点为 pH7-7.8，在强碱下长时间浸渍，其等电点会下降至 pH4.7-5.3，并伴有溶解现象。p 胶原不溶于水，但可溶于热水。膨润的胶原经加热后，会产生不可逆收缩，加热至 63-65 时，纤维长度变为原来的 1/9，若再加热，三股螺旋分开，发生热变性，形成明胶。p 未变性的胶原可被酸性红染成红色，变性者则否。胶原的提取 -牛肌腱胶原的制备p 将湿重 100克牛肌腱洗净， 0.5%Tris处理后取出肌腱进行切片，用 75%酒精溶液进行消毒处理，用灭菌蒸馏水冲洗后用匀浆器匀浆， 再用灭菌蒸馏水洗涤。p 以 5000r/min离心 15分钟，收集沉淀再悬浮于生理盐水中1小时。以 5000r/min离心 15分钟，再将肌腱悬浮至于1.5L含水果蛋白酶 2mg的 0.05mol/l的醋酸溶液中，在 4下慢慢搅拌消化 72小时。以 5000r/min离心 15分种。p 将上清液用 0.lmol/l的 NaOH调节 pH值至中性，加入 NaCl至最终浓度达 2.5mol/L左右。搅拌过夜，在中性条件下进行盐沉淀。p 以 5000r/min离心 15分种。沉淀即主要为 1型胶原蛋白。p 将沉淀用冷的灭菌蒸馏水作短时间洗涤，然后溶解在0.05mol/l的醋酸溶液中，以 0.05mol/l的醋酸溶液作透析外液在 10 下透析 2天，然后在 PH 为 7.4的含 130mmol/l的 NaCl溶液中透析。物理改性方法p 通过物理手段对胶原蛋白改性有 紫外线照射 、 重度脱水 、射线照射 和 热交联 等方法。p 胶原溶液如被紫外线照射 ,将在分子间产生交联 ,粘度增加,生成凝胶。目前常用的紫外线改性胶原膜的方法是将胶原膜放在铝箔上 ,距离 254 nm 紫外灯 20 cm 高度 ,照射 1 5 h 。对经紫外线照射的胶原膜进行力学性能和胶原酶试验表明 :交联胶原膜的收缩温度 Ts 和抗胶原酶解的能力均显著高于未交联胶原膜。p 重度脱水也是胶原蛋白物理改性中常用的方法 ,该法是通过脱水导致胶原分子间交联 ,从而增加变性温度 ,改善胶原的性能。p 物理方法改性胶原蛋白的优点是可避免外源性有毒化学物质进入胶原内 ,缺点是胶原交联度低 ,且难以获得均匀一致的交联。化学改性方法p 主要是通过化学交联进行改性。p 交联剂按交联键发生的部位可分为两种 :一种是 分子内交联 ,它是在同一个螺旋内两条肽链之间形成的交联键 ,这类交联键主要影响交联产物的 变性温度和拉伸强度 等性能 ;另一种是 分子间交联 ,它是在两条相邻的螺旋间的肽链中形成的交联键。这类交联键主要影响交联产物的 溶胀性和表面延伸性 。当两条微纤维之间的距离小于交联剂分子的长度时 ,交联也可以在 两条相邻的微纤维 之间发生。p 目前常用的化学交联剂有 戊二醛 、 1 ,6 - 己二异氰酸酯 ( HDI) 、碳二亚胺 ( EDC) 、叠氮二苯基磷 (DPPA) 、酰基叠氮化物、聚环氧化物以及京尼平等。p 将制备的胶原膜或者海绵置于 0.25% 戊二醛溶液中预交联 10 min 后，浸泡于含0.25% 戊二醛的 0.05 mol/L 醋酸溶液，于 4 交联 24 h， PBS 缓冲液漂洗 3 次。化学交联戊二醛交联法p 戊二醛是到目前为止应用最广泛的蛋白质交联剂 ,其水溶液在室温下就能高效地与胶原缩氨酸链上的氨基反应 ,形成稳定交联。p 是一种同型双功能交联剂。其两个醛基可分别与两个相同或不同分子的伯氨基形成 Schiff 碱 , 将两个分子以五碳桥连接起来。高浓度的 GTA 与胶原分子赖氨酸或羟赖氨酸残基 E2氨基反应 , 形成分子间交联。p 戊二醛与蛋白质交联的特点是活性高、反应快、产物稳定、对沸水、酸、酶的抵抗能力强 ,但有细胞毒性 , 且其用量难以控制 。化学交联 EDC交联法p 1一乙基一 3-(3一二甲基氨基丙基 )一碳化二亚胺（ EDC） 是化学性质极为活泼的化合物 , 能使氨基和羧基之间形成酰氨键 , 其既可与羧基结合 , 也可与氨基结合 , 通常羧基与 EDC 反应生成中间产物 , 再与另一分子的氨基反应而形成偶联物。 EDC反应的 pH 为 5 9, 一般胶原交联选择 pH7 左右 , 4 或室温 24h。化学交联 EDC交联法p 将胶原海绵浸入 50ml含 50 mmol/L的 2-(N-吗琳)乙撑磺酸 (MES)的体积分数为 40%的乙醇溶液中，室温下浸泡 30 min。p 加入 (EDC) 65 mg和 N-基唬拍酞亚胺 (NHS)15 mg，摇动使之溶解，室温下反应数小时。p 分别用无菌 0.lmol/L Na2HP04, 1 mol/L NaCl和蒸馏水冲洗胶原海绵，再次冷冻干燥。应用胶原可以用于制造止血海绵、创伤辅料、人工皮肤、手术缝合线、组织工程基质等。胶原在应用时必须交联，以控制其物理性质和生物可吸收性。戊二醛和环氧化合物是常用的交联剂。残留的戊二醛会引起生理毒性反应，因此必须注意使交联反应完全。胶原交联以后，酶降解速度显著下降 。应用 -作为药物和基因输